朱葛丽+臧淑妃+娄国强+施军平
[摘要] 意图 评论5-脂氧化酶（5-LO）通路在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的效果。 办法 将4周龄ApoE-/-雄性小鼠16只随机分为两组：对照组（一般饲料）、NASH模型组（高脂高胆固醇饲料）。接连喂食12周后，肝安排油红染色调查脂肪变，选用HE染色进行NAFLD活动度评分（NAFLD activity score，NAS）。荧光定量RT-PCR检测5-LO、BLT1等mRNA表达，Western Bot法检测5-LO蛋白，酶联免疫法检测肝脏白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）。 成果 高脂高胆固醇饮食12周能诱导ApoE-/-小鼠呈现NASH体现，建模成功。NASH模型组较对照组肝安排5-LO mRNA及蛋白表达显着升高（P<0.01），肝匀浆LTB4水平[（71.09±18.23）pg/mL vs （46.71±11.71） pg/mL]升高（P<0.01），其受体BLT1 mRNA水平显着升高（P<0.01），中性粒细胞趋化因子和相应受体MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表达均较对照组显着升高（P<0.01）。 定论 5-LO炎症通路经过上调中性粒细胞粘附滋润相关因子，诱导中性粒细胞滋润，促进非酒精性脂肪性肝炎发展。
[关键词] 5-脂氧化酶；脂肪性肝炎；非酒精性；中性粒细胞
[中图分类号] R575 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）28-0035-04
跟着人们饮食和生活方式的改动，与肥壮和代谢综合征（metabolic syndrome，MetS）相关的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病率逐年攀升，在一般人群中发病率达30%以上，而在肥壮个别中乃至抵达80%以上，严重威胁人类健康[1]。既往研讨标明，肝小叶内中性粒细胞[neutrophil，也称多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）]滋润是NASH前期的特征性病理改动[2]，但经典TLR4 致炎信号通路激活不能彻底解说其发病。新近研讨显现，5-LO炎症通路反常激活在MetS相关疾病包含肥壮、胰岛素反抗、动脉粥样硬化等疾病中参加体系性缓慢低度炎症的构成[3，4]，敲除5-LO 或BLT1 基因可使小鼠反常代谢表型显着减轻[5，6]；但现在相关研讨更多会集在外周脂肪安排，这条致炎通路在NASH前期肝小叶内PMNs 滋润进程中效果怎么有待进一步研讨。本研讨使用ApoE基因敲除（ApoE-/-）的高脂高胆固醇饮食诱导NASH小鼠模型，调查该通路反常在NASH前期肝小叶内中性粒细胞滋润进程中的可能效果。
1材料与办法
1.1 动物模型的树立及选材
SPF级4周龄C57BL/6J ApoE-/-雄性小鼠16只（购于南京大学国家遗传工程小鼠资源库），养殖于杭州师范大学动物试验中心SPF级动物房，适应性养殖1周后，随机均分为两组：对照组（n=8）予一般饲料喂食； NASH模型组（n=8）予高脂高胆固醇饲料（D12079B，Reasearch Diet，美国）喂食。接连喂食12周后处死动物，惯例收集血清标本，由肝左叶固定部位选材，制备肝脏白腊切片和冰冻切片，其他肝安排-80℃冷冻保存备用。本研讨获杭州师范大学道德委员会查看经过。
1.2肝脏病理学查看
肝脏冰冻切片行油红O染色调查肝细胞脂肪变，白腊切片HE染色调查肝细胞脂肪变性程度、气球样变、小叶内及汇管区炎症程度以核算NAFLD活动度计分（NAFLD activity score，NAS）。
1.3 荧光定量RT-PCR
取适量肝安排，Trizol法提取总RNA，取总RNA 2 μg选用逆转录试剂盒（Roche）组成cDNA，再将逆转录产品3 μL在荧光定量PCR仪进行PCR扩增，以18S为内参，以2-ΔΔCT比较相关基因的表达水平，各基因引物见表1。
1.4 Western Blot
取适量肝安排用RIPA裂解液裂解，上清液行蛋白浓度测定后，将等量样品参加5X蛋白上样缓冲液，95℃ 5 min变性。各组蛋白上样50 μg，用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行惯例电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温关闭30 min，按1∶1 000 参加兔抗小鼠5-LO（Abcam）一抗及兔抗小鼠β-actin（CST）一抗，4℃孵育过夜。TBST 洗膜3次。按1∶5000参加山羊抗兔IgG（Abcam）二抗，室温孵育1 h，TBST 洗膜3次，化学发光成像体系收集图画并进行剖析。
1.5肝安排LTB4检测
取肝安排15 mg参加生理盐水500 μL进行匀浆，选用SPE（C-18）柱形筒（CAYMAN）萃取待检液，根据ELISA试剂盒（CAYMAN）说明书进行检测。
1.6 统计学办法
选用SPSS 17.0统计学软件剖析，计量材料用均数±规范差（x±s）标明，两组间比较选用t查验，方差不齐则选用秩和查验，计量材料相关性剖析选用Pearson查验。双侧P<0.05为差异有统计学含义，P<0.01为差异有高度统计学含义。
2 成果
2.1 肝安排病理学改动
油紅O染色成果显现：对照组小鼠肝安排无显着脂肪变，NASH模型组则呈现显着脂肪变。HE染色成果显现：对照组肝脏肝小叶及门管区结构明晰，未见显着脂肪变、气球样变以及炎症细胞滋润；NASH模型组肝细胞呈现弥漫性脂肪变及不同程度气球样变，肝小叶内有显着炎症细胞滋润，核算NAS积分为3～7分，其间75%>4分抵达NASH确诊规范。
2.2肝安排中5-LO/BLT1及相关炎症因子mRNA表达水平
NASH模型组肝安排中5-LO以及BLT1 mRNA的表达均较对照组显着升高（P<0.01），一起NASH模型组中性粒细胞趋化因子和相应受体MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表达均较对照组显着升高（P<0.01），见图1。
2.3肝安排中5-LO、BLT1 mRNA表达水平与NAS积分的相关性剖析
对NASH模型组肝安排中5-LO以及BLT1 mRNA的表达水平与NAS积分进行Pearson相关剖析，成果标明：5-LO mRNA的表达水平与NAS积分呈正相关（r=0.891，P<0.01）；BLT1 mRNA的表达水平与NAS积分呈正相关（r=0.889，P<0.01）。
2.4 肝安排5-LO蛋白表达水平
NASH模型组肝安排中5-LO的蛋白表达量较对照组显着升高（图2）。
2.5肝安排LTB4水平
NASH模型组肝安排中LTB4水平为（71.09±18.23）pg/mL，较对照组的（46.71±11.71）pg/mL显着升高（t=-3.18，P<0.01）。
3 评论
本研讨用ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠辅以高脂高胆固醇饮食，模仿现代盛行的饮食习惯，树立非酒精性脂肪性肝炎的动物模型。本课题组前期研讨发现该模型一起伴跟着血糖升高、胰岛素反抗，兼并肥壮、脂质代谢紊乱等，契合人类NASH发病进程。与前期成果共同，ApoE-/-小鼠高脂高胆固醇饮食12周能成功树立NASH模型。
中性粒细胞是外周血中数量最多的白细胞，作为最早抵达炎症部位的免疫细胞，参加构成机体的第一道防地。来自本课题组以及国外研讨均发现NASH前期肝小叶内存在中性粒细胞滋润这一特征性病理改动[7，8]。近年研讨共同以为，以模式识别受体Toll 样受体（TLRs）和库普弗细胞（KC）为主介导的天然免疫反常介导了肝脏炎症的发作：脂肪变的肝细胞在脂质代谢中心产品所诱导的脂毒性、氧应激、内质网应激等多重影响下开释损害相关风险信号，激活KCs、肝星状细胞和肝本质细胞等表达的TLRs，招募炎症细胞并扩展肝脏炎症[9，10]。但上述经典的发病机制并不能解说肝小叶内中性粒细胞滋润这个NASH 前期的特征性病理改动。在不同饮食配方诱导的TLR4和TLR9基因敲除小鼠NASH 模型中，仅能必定程度减轻肝脏损害但不足以彻底按捺肝脏炎症的发作[11，12]，提示虽然TLRs信号介导炎症扩展进程，但在前期的炎症发动阶段可能存在着更为重要的非TLRs 依靠的炎症激活途径。
白三稀是一种经典的促炎性脂质代谢中心产品，由必需脂肪酸n-6多不饱满脂肪酸（PUFA）转化生成的花生四烯酸（AA）在5-LO催化下构成，然后经高亲和力受体BLT1和低亲和力受体BLT2表达广谱和高效的致炎效应包含开释趋化因子、招募PMNs、淋巴细胞等，其间5-LO、LTB4 和BLT1作为中心信号分子介导炎症触发和扩展进程[13，14]。国外有研讨发现予小鼠高脂饮食后，在肝脏和肌肉中LTB4 表达添加[15]。本研讨也调查到NASH模型组肝脏LTB4排泄添加，一起发现其催化酶5-LO在mRNA及蛋白表达水均匀较对照组升高，其受体BLT1水平显着升高，进一步剖析5-LO、BLT1 mRNA表达量与NAS积分的相关性，成果示跟着肝脏脂肪变以及炎症的发展，5-LO、BLT1mRNA表达量呈正相关。最近的研讨显现高脂血症可经过调理5-LO促进中性粒细胞发作LTB4，然后导致炎症的发作[16]。因而，脂代谢反常导致的5-LO致炎信号通路可能在NASH前期炎症发动尤其是特征性的肝小叶内PMNs 滋润进程中起了重要效果，可能主要由失衡的PUFAs 中心代谢产品为此炎症进程供给了某种触发或扩展信号。
外周血液中的少数岗兵PMNs 在感知特异性风险信号后可被相应部位内皮细胞捕获、阻滞、粘附并跨过内皮细胞迁移至炎症部位，一起敏捷促进其他PMNs向损害安排很多滋润。既往研讨标明，安排损害后，中性粒細胞当即开释脂质介质，导致中性粒细胞进一步激活，激活的中性粒细胞进一步开释趋化因子和炎症反响的扩展，一步激活和炎症反响的扩展，经过正反馈性的调理引起炎症瀑布[17]。在炎症性疾病比方类风湿性关节炎和过敏性哮喘疾病中，开释的LTB4经过激活中性粒细胞LTB4受体BLT1招募更多的中性粒细胞，BLT1/中性粒细胞进一步激活开释IL-1，其次诱导细胞开释CCR1、CXCR2配体，中性粒细胞的招募被趋化因子极大的扩展[18，19]。本研讨中调查到NASH模型组中性粒细胞趋化因子和相应受体MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表达均较对照组显着升高，提示5-LO炎症通路经过脂质-细胞因子-趋化因子轴调控炎症反响进程，并作为初始信号触发后续细胞因子、趋化因子的开释而参加中性粒细胞或混合性炎症细胞招募和终究免疫效应的完成[20]。
本研讨显现，肝细胞脂质代谢反常激活5-LO炎症通路，LTB4组成添加，促进中性粒细胞趋化因子、粘附分子开释，招募中性粒细胞向炎症部位滋润和触发后续炎症反响，形成安排损害。肝脏5-LO、BLT1与NAS积分显着正相关，提示5-LO炎症通路在NASH的疾病发展中发挥重要效果。为清晰5-LO炎症通路在NASH中的效果，本课题组将进一步使用药物阻断该炎症通路，为研讨医治NASH新的效果靶点供给试验根据。
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（收稿日期：2016-06-17）
