能引起气道滑润肌舒张：KATP通道开放剂对气道滑润肌细胞增殖表达及SOCS3/5免疫失衡的影响_old_新闻_资讯

邓伊++王志强

[摘要] 意图研讨ATP敏感性钾通道（KATP通道）敞开剂对气道滑润肌细胞（ASMCs）增殖进程的影响，以及细胞因子信号转导按捺蛋白3/5（SOCS3/5）表达改变与转化成长因子-β1（TGF-β1）排泄开释水平的联系。办法体外构建增殖型ASMCs原代培育细胞模型，分为ASMCs组、AngⅡ·ASMCs组、淋巴细胞（L）组、ASMCs+L组和AngⅡ·ASMCs+L组。Real-time PCR检测细胞中SOCS3 mRNA及SOCS5 mRNA表达的差异；ELISA法检测上清液中TGF-β1的开释水平。调查KATP通道敞开剂尼可地尔（NCR）干涉的影响。成果与ASMCs组比较，AngⅡ·ASMCs组TGF-β1的表达水平显着升高（P<0.01）；NCR效果于细胞后各组ASMCs表达TGF-β1与格列本脲（GLI）比较显着削减（P<0.05）。与ASMCs+L组比较，AngⅡ·ASMCs+L组SOCS3 mRNA表达添加，而SOCS5 mRNA表达削减（P<0.05）。NCR可以下调SOCS3的表达，上调SOCS5的表达。定论 KATP通道敞开可以经过按捺ASMCs增殖而调控TGF-β1排泄表达；SOCS3和SOCS5可能是哮喘气道重塑的特异性免疫医治中的重要靶点。

[关键词] KATP通道敞开剂；气道滑润肌细胞；细胞因子信号转导按捺因子；哮喘

[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）10（b）-0004-04

细胞因子信号转导按捺因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）是近年来新发现的一类负向调理因子[1]，参加多种细胞因子信号转导进程，其间SOCS3和SOCS5作为SOCS宗族的重要成员，可能与哮喘等免疫性疾病的发作、开展有关，并有望成为这类疾病的医治靶点。有研讨阐明[2]，ATP敏感性钾通道（KATP通道）敞开剂对哮喘的气道重塑可以发生有利的效果，其机制没有见体系性的研讨报导。本研讨利用在体外原代培育的哮喘大鼠气道滑润肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs），树立增殖型ASMCs模型，探究KATP通道敞开剂的效果是否与反转气道滑润肌细胞增殖有关，以及对SOCS3/5免疫失衡的影响，为医治哮喘等免疫失衡疾病树立新的办法供给理论基础。

1 材料与办法

1.1 试验材料

淋巴细胞别离液，购自碧云天；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）符号羊抗兔二抗，购自武汉博士德生物工程有限公司；α-肌动蛋白（α-SMA）单抗，购自Boster；SOCS3/5引物，上海生工；大鼠转化成长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）ELISA试剂盒，购自伊莱瑞特生物科技有限公司；高糖DMEM培育基，购自美国Gbico BRL公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）打针液，浙江仙据制药股份有限公司；尼可地尔（nicorandil，NCR），日本Tohoku Nipro医药公司；血管严峻素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）、Ⅰ型胶原酶（collagenaseⅠ）、格列本脲（glibenclamide，GLI）均购自Sigma公司。

1.2 试验办法

1.2.1 细胞培育及判定雄性SD大鼠，SPF级，年纪21～36 d，体重100～140 g，由三峡大学试验动物中心供给。办法参阅相关文献进行改善[3]。以10%的水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔打针麻醉大鼠，放入超净台中，开胸取出气管，刮去外膜内膜，D-Hank′s液洗净，剪碎、消化后，用20%胎牛血清的高糖DMEM培育基，5%CO2培育箱中37℃静置培育1周左右，可见细胞从安排块周围爬出。试验用3～6代细胞，免疫细胞化学染色判定滑润肌细胞上特有的α-SMA。

1.2.2 AngⅡ诱导ASMCs的增殖与表达 AngⅡ（100 nmol/L）处理ASMCs，接连效果3 d，24 h换一次液；Western blotting检测α-SMA，鉴定AngⅡ对ASMCs增殖诱导效果；上清中TGF-β1排泄表达用ELISA检测（按阐明书操作），分为ASMCs组和AngⅡ·ASMCs组。

1.2.3 AngⅡ·ASMCs与淋巴细胞共培育以AngⅡ处理ASMCs后，D-Hank′s液洗3遍，消化重悬，以1×106 cell/L铺于6孔板中，待细胞贴壁成长24 h，参加提取的2 ml T淋巴细胞（1×105 cell/L），效果36 h，分为L组、ASMCs+L组和AngⅡ·ASMCs+L组。

1.2.4 Real-time PCR检测SOCS3和SOCS5在共培育体系中的表达 ①搜集上清中的淋巴细胞，（5～10）×106单个核细胞加Trizol 1 ml，混匀后Trizol法提取总RNA，紫外分光光度法测定RNA含量。②RT-PCR反响体系：RNA 4.0348 μg，Oligo（dT）15（10 μmol/L）2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，ddH2O（RNAse free）至14.5 μl，70℃ 5 min，时间短离心后置于冰上；以上PCR管悉数14.5 μl，5×RT缓冲液4 μl，HRP（RRI）/RNAse Inhibitor 0.5 μl，M-MLV 1 μl，ddH2O（RNAse free）至20 μl，42℃ 60 min，95℃ 5 min。③Real-time PCR反响体系：β-actin f（10 μmol/L）0.5 μl，β-actin r（10 μmol/L）0.5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，Ex Taq 0.25 μl，10×Ex Taq E缓冲液2.5 μl，cDNA 1 μl，ddH2O至25 μl，94℃ 4 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 25 s，30个循环，72℃ 4 min，4℃ 4 min，引物序列及扩增条件见表1。

表1 Real-time PCR反响的引物序列及扩增条件

1.2.5 KATP通道调理剂处理细胞 NCR（敞开剂）处理ASMCs以及共培育组细胞，并以DEX（医治药）和GLI（拮抗剂）别离作为阳性对照和阴性对照。加药后细胞培育36 h，每12小时换一次液。Real-time PCR检测SOCS3和SOCS5的表达差异；上清中TGF-β1排泄表达用ELISA检测。

1.3 统计学处理

选用SPSS 13.0统计学软件进行数据剖析，计量材料以x±s表明，选用t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。

2 成果

2.1 AngⅡ效果于ASMCs的增殖与表达

2.1.1 Western blotting检测α-SMA的表达 BandScan剖析胶片灰度值剖析后两组α-SMA/β-actin的比较如图1，可见，AngⅡ处理后的ASMCs表达α-SMA水平比未用AngⅡ处理的ASMCs组显着升高，阐明AngⅡ处理ASMCs后可使细胞增殖。

图1 AngⅡ处理前后ASMCs增殖的比较

α-SMA/β-actin代表ASMCs增殖量，与ASMCs组比较，*P<0.01

2.1.2 ELISA法检测上清液中TGF-β1表达的差异与ASMCs组比较，AngⅡ·ASMCs组TGF-β1的表达水平显着升高（P<0.01）（图2）。

图2 AngⅡ处理ASMCs前后TGF-β1表达的差异

与ASMCs组比较，*P<0.01

2.2 SOCS3和SOCS5 mRNA在共培育体系中的表达

荧光定量PCR成果选用ΔΔCt法核算：意图基因相对表达量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=试验组（Ct意图基因-Ct内参基因）-对照组（Ct意图基因-Ct内参基因），所以2-ΔΔCt表明意图基因相对于内参基因的相对表达量。ASMCs与淋巴细胞共培育后，SOCS3 mRNA表达添加，而SOCS5 mRNA表达削减（P<0.05）；与ASMCs+L组比较，AngⅡ·ASMCs与淋巴细胞共培育，SOCS3 mRNA表达添加，而SOCS5 mRNA表达削减（P<0.05）（表2）。

表2 SOCS3和SOCS5基因表达相对量2-ΔΔCt值（x±s，n=3）

与L组比较，*P<0.05；与ASMCs+L组比较，#P<0.05

2.3 KATP通道敞开剂效果成果

2.3.1 药物效果后上清中的TGF-β1表达差异在各组用药后DEX和NCR使ASMCs表达TGF-β1水均匀比用拮抗剂GLI显着削减（P<0.05）；而AngⅡ处理ASMCs后排泄表达TGF-β1比ASMCs组显着添加（P<0.01）（表3）。

表3 检测上清中的TGF-β1表达差异（x±s，n=3）

与拮抗剂GLI比较，*P<0.05；与ASMCs组比较，#P<0.01

2.3.2 药物效果后SOCS3和SOCS5表达差异与拮抗剂GLI比较，DEX和NCR效果与共培育体系可以下调SOCS3 mRNA的表达水平，上调SOCS5 mRNA的表达水平（表4）。

3 评论

支气管哮喘以慢性气道炎症和气道重塑为首要特征，随同发作气道高反响，而气道重塑的机制和医治药物是现在研讨的热门。支气管滑润肌细胞是支气管首要的结构细胞，其反常增殖在气道重塑中起到十分重要的效果[4-5]。气道滑润肌细胞增生的直接成果是形成气道壁的增厚，加剧气道的狭隘，发气愤道高反响性，形成呼吸道气流受限，与哮喘严峻程度密切相关。因而，有用遏止气道滑润肌细胞过度增殖，是医治难治性哮喘的根本途径之一[6]。缩短型ASMCs无增殖和搬迁才能，对外界影响发生缩短反响，增殖/组成型可以排泄表达多种活性物质，具有增殖、搬迁的才能[7]。本试验选用AngⅡ诱导，在体外树立增殖型ASMCs与淋巴细胞共培育模型，成果显现，ASMCs的增殖可以调理Th1/Th2免疫相关细胞因子信号转导按捺因子的平衡，促进SOCS3的表达而按捺SOCS5的表达，然后使SOCS3/5免疫失衡，表现为SOCS3与炎症反响正相关，而SOCS5则相反。TGF-β1的组成排泄与ASMCs增殖呈正相关，阐明TGF-β1可能参加哮喘ASMCs的增殖进程，在哮喘的发病进程中有重要的效果。TGF-β1与气道损害后的修复进程及气道重塑有密切联系，其在气道中表达增高能影响气道滑润肌细胞ASMCs割裂与增殖，导致滑润肌增生和肥厚及气道重塑，然后加剧哮喘。

钾通道是体内一种重要的离子通道，它广泛散布于各种器官安排的细胞膜，在调理膜电位和兴奋性方面起着重要效果；滑润肌上至罕见三种钾通道：钙激活钾通道（KCa）、迟整流钾通道（Kdr）、KATP。其间，KATP最为重要，当该通道敞开时，发生一系列电化学反响，有用舒张滑润肌、起到降压解痉的效果[8]，因而，KATP通道是多种疾病的医治靶点。本试验成果显现，KATP通道敞开剂对ASMCs的增殖有按捺效果，相应地TGF-β1也随之削减，与拮抗剂有显着的差异；一起，又可下调SOCS3 mRNA的表达，上调SOCS5 mRNA的表达，然后反转ASMCs增殖所造成的的SOCS3/5表达失衡，阐明KATP通道敞开剂可以按捺气道滑润肌细胞增殖和排泄。

现在以为[9-12]，SOCS经过两条通路按捺信号传导的效果，即JAK激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT），有丝割裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调理激酶（MAPK/ERK），可是当时对JAK/STAT通路研讨较多，对MAPK/ERK通路研讨较少。SOCSs经过细胞内JAK-STAT体系信号途径调理细胞信号转导，参加细胞炎性反响、细胞增殖与分解等生物学功用的调理。已有研讨发现，SOCS蛋白对Th细胞的分解具有重要的调控效果[9，13-14]，其间SOCS5/3与Th1/Th2免疫失衡密切相关，SOCS3首要表达在Th2细胞中并按捺Th1型免疫反响，SOCS5经过按捺Th2细胞因子信号转导促进Th1细胞分解[15-17]。因而以为KATP敞开剂可以按捺气道滑润肌细胞增殖排泄，并经过调理Th1/Th2免疫因子和SOCS蛋白的免疫平衡发生医治效果，此方面的研讨可望为临床对哮喘的防备和医治供给新的思路。

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（收稿日期；2014-06-05 本文修改：郭静娟）