郭海雷 卢才教 刘政军 凌翔伟 胡德林 方林森
[摘要] 意图 觀察前期脓毒症大鼠模型心脏冠状动脉内皮与心肌细胞危害状况，评论内皮细胞在心肌危害中发挥的效果。 办法 SD大鼠72只，随机分为正常、假手术和脓毒症组，选用盲肠结扎加穿孔术（CLP）制备脓毒症模型，术后3 h、6 h、12 h和24 h丈量心肌力学目标，包含左室缩短峰压（LVSP）、左室压力最大上升速率（+dp/dt max）和左室压力最大下降速率（-dp/dt max），并丈量血清内皮素1（ET-1）、一氧化氮（NO）、肌钙蛋白I（cTnI）水平，透射电镜调查冠状动脉内皮细胞和心肌细胞超微结构改动。 成果 脓毒症组NO和ET-1水平在术后即显着升高，12 h达峰值；NO和ET-1比值在CLP术后3 h即开端显着下降，继续低于正常水平。冠状血管内皮细胞超微结构危害呈逐渐加剧，管腔内掉落内皮细胞数目增多，内皮细胞超微结构危害评分逐渐增高。CLP后3 h即呈现缩短舒张功用显着下降，LVSP、±dp/dt max术后6 h达最低；脓毒症组血清cTnI在术后即显着升高，12 h时点达峰值；脓毒症组心肌细胞超微结构显现肌原纤维、肌浆网、线粒体等危害逐渐加剧，但线粒体数目有增多现象。 定论 脓毒症前期即存在显着冠状动脉内皮危害，心肌细胞危害和心肌功用妨碍，内皮细胞在心肌危害中可能扮演重要人物。
[要害词] 脓毒症；内皮细胞；心肌细胞；肌钙蛋白I；内皮素
[中图分类号] R656.7；R459.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）10-0037-05
Study on the early vascular endothelial and myocardial damage in rats with sepsis and its correlation
GUO Hailei1 LU Caijiao1 LIU Zhengjun1 LING Xiangwei1 HU Delin2 FANG Linsen2
1.Burn and Wound Center，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000，China； 2.Department of Burn Surgery，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，China
[Abstract] Objective To observe the damages of coronary artery endothelium and myocardial damage in the rat model of early sepsis and to explore the role of endothelial cells in myocardial damage. Methods 72 SD rats were randomly divided into normal， sham-operation and sepsis groups. Cecal ligation and perforation（CLP） was used to prepare sepsis model. 3 h， 6 h， 12 h and 24 h after surgery， indices of myocardial mechanics were measured， including left ventricular systolic pressure （LVSP）， maximum increasing rate of left ventricular pressure （+dp/dt max） and maximum decreasing rate of left ventricular pressure（-dp/dt max）. The levels of endothelin 1 （ET-1）， nitric oxide（NO）， troponin I （cTnI） were measured. TEM was used to observe endothelial cells of coronary artery and myocardial ultrastructure changes. Results The levels of NO and ET-1 in sepsis group were increased significantly after operation and peaked at 12 hours； the ratio of NO to ET-1 was decreased significantly at 3 h after CLP， and remained below normal level. Coronary endothelial cell ultrastructure damage was gradually increased， exfoliative endoluminal endothelial cells were increased， and endothelial cell ultrastructure damage score was gradually increased. 3 h after CLP， the systolic and diastolic function was decreased significantly. LVSP， ±dp/dt max reached the lowest at 6 h after operation； serum cTnI in sepsis group was increased significantly after operation and peaked at 12 h. The ultrastructure of myocardial cells in sepsis group showed that the myofibrils， sarcoplasmic reticulum， mitochondria and other damages were gradually aggravated， but there was an increase in the number of mitochondria. Conclusion In the early stage of sepsis， there are obvious coronary endothelial damage， myocardial cell damage and myocardial dysfunction. Endothelial cells may play an important role in myocardial damage.
[Key words] Sepsis； Endothelial cells； Myocardial cells； Troponin I； Endothelin
脓毒症是指因感染引起机体反响失调而引起致命性多脏器功用妨碍，存在循环、细胞和代谢功用反常[1]。脓毒症和脓毒性休克现在仍是引起逝世的重要原因，每年全球脓毒症患者数量超越数百万，约1/4乃至更多患者因而逝世[2]。现在脓毒症的病理生理学机制没有彻底清晰，其间内皮细胞作为炎症反响的重要靶细胞和效应细胞，其凋亡、掉落、通透性改动，失控性排泄多种细胞因子和炎性物质，引起凝血功用紊乱等在脓毒症开展中发挥重要效果[3，4]。脓毒症心功用妨碍体现为心肌缩短、舒张功用下降，是一种“功用性”、可逆性改动，是严峻脓毒症的常见并发症，兼并心功用妨碍患者病死率可达70%～90%，被以为是脓毒性休克患者病死率的独立风险要素[5]。本试验选用经典的CLP脓毒症大鼠模型，经过检测血清NO、ET-1和cTnI水平，测定心肌力学、透射电镜下调查冠状动脉内皮和心肌细胞细胞核、线粒体、肌原纤维等超微结构改动，深化了解脓毒症大鼠前期血管内皮、心肌细胞危害和心肌功用妨碍状况，评论内皮细胞可能在脓毒症心肌危害中扮演的人物。
1 材料与办法
1.1 动物分组与脓毒症模型制备
SD大鼠72只，清洁级，♂♀参半，体重（250±30）g（购于安徽醫科大学动物中心）。SD大鼠染色编号后随机分正常组（N组）、假手术组（S组）和脓毒症组（C组），S组和C组又分为手术后3 h、6 h、12 h和24 h四个亚组（S1，S2，S3，S4，C1，C2，C3，C4），每组8只SD大鼠，动物分笼养殖。
运用CLP法仿制脓毒症模型：SD大鼠皮下打针水合氯醛（浓度10%，0.03 mL/kg），麻醉显效后固定，腹正中线切开约1.5 cm，拉出盲肠，根部丝线结扎，用18号打针针头贯穿盲肠3次，揉捏盲肠见有粪便流出，回纳盲肠后逐层关腹。术后当即在大鼠皮下打针NS 5 mL防备休克。S组大鼠仅行盲肠探查术。
1.2 心肌力学丈量
N组在3 h时点，S组和C组在3 h、6 h、12 h和24 h四时点分批用水合氯醛（浓度10%，0.03 mL/kg）麻醉大鼠，固定，颈部去毛后切开皮肤，找到、别离左颈内动脉，将导管置入左心室内，选用生物机能试验体系（BIOPAC-11A2055型）丈量3 h、6 h、12 h和24 h时点的LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max，安稳2 min后记载数值。心肌力学测定后开腹，从腹主动脉留取血标本待检测。动物失血逝世后当即开胸取出心脏，切取部分心肌和冠状动脉置于戊二醛液（浓度2.5%）中固定。
1.3 冠状动脉内皮细胞和心肌细胞电镜下调查
戊二醛溶液固定后的冠状动脉和心肌安排经包埋、切片后在JEM-1230型透射电镜下调查超微结构。
1.4 血管内皮细胞超微结构危害评分
依据大鼠冠状动脉血管内皮细胞在透射电镜下超微结构改动，依照有关文献[6]稍作改动后对血管内皮细胞危害程度进行评分，评分标准见表1。
1.5 cTnI、NO和ET-1测定
留取的血标本4000转/min离心10 min，别离血清放置-80℃冰箱保存。运用酶联免疫法检测血清cTnI、ET-1水平，硝酸还原法检测血清NO水平。
1.6 统计学办法
选用SPSS19.0统计学软件进行剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）表明，进行独立样本t查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 血清NO、ET-1和内皮细胞超微结构危害评分的改动
与S组和N组比较，C组血清NO、ET-1术后3 h即继续升高（P<0.01），24 h时点较前略有回落，但仍保持较高水平；NO和ET-1比值CLP术后3 h即开端逐渐下降，显着低于N组和S组（P<0.05）；C组大鼠CLP术后3 h冠状动脉血管内皮细胞超微结构危害评分即开端升高，分值逐渐增大。见表2。
2.2 心肌力学和血清cTnI改动
与S组和N组比较，C组心肌力学目标（LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max）术后3 h即显着下降，在6 h达谷底，12 h后有所上升，但仍显着低于对照组（P<0.05）；C组术后3 h血清cTnI水平继续升高，显着高于一起点S组与N组（P<0.01），24 h时点有回落趋势，但仍显着高于正常水平。见表3。
2.3 冠状动脉内皮细胞和心肌细胞电镜下改动
CLP术后3 h 大鼠冠状动脉血管内皮细胞体现为水肿，概括变圆，线粒体也呈现肿胀；CLP术后12 h冠状动脉血管内皮细胞部分可见核舒展和染色体边集，胞内溶酶体数目添加，部分线粒体脊突结构损坏消失，可见部分内皮细胞与血管基膜别离；CLP术后24 h可见较多概括不清的冠状动脉血管内皮细胞，胞内较多线粒体脊突结构消失，呈现核固缩和空泡样改动，冠状动脉管腔内可见数目较多的凋亡掉落的内皮细胞（图1～4）。
CLP术后3 h SD大鼠心肌肌原纤维距离离开端逐渐增宽、溶解，肌浆网扩张，线粒体肿胀，随脓毒症开展危害逐渐加剧，CLP术后24 h心肌肌原纤维结构损坏严峻，很多肌原纤维开裂、溶解，并见部分线粒体结构含糊，但数目有增多体现（图5～8）。
3 评论
现在脓毒症发病机制尚不彻底清晰，以为失控性炎症反响、凝血功用妨碍和微血管功用紊乱在脓毒症病理生理改动中担任要害人物，其间内皮细胞的激活和危害在脓毒症开展进程中发挥重要效果[7-9]，是SIRS、MODS、MOF发作开展进程中的要害环节之一。关于脓毒症心功用妨碍的病理生理学机制尚不清晰，现在研讨以为心肌按捺因子、氧化应激、线粒体功用危害、神经内排泄调理妨碍、能量反常代谢等方面可能参加脓毒症心功用妨碍的病理生理进程，心肌危害是脓毒性休克患者病死率的独立风险要素，可影响脓毒症患者预后[5]。
内皮细胞作为炎症反响的重要靶细胞因钙超载危害而发作凋亡和坏死，内皮细胞与基膜别离、掉落，血管通透性添加，炎性细胞游走到脏器安排，促进安排炎症反响加剧；内皮细胞作为效应细胞排泄多种细胞因子和炎性介质，构成安排器官危害加剧，加快脓毒症的进程[10-12]。ET-1和NO主要由内皮细胞发作的血管缩短和舒张调理物质，二者排泄失调时可构成严峻的机体安排缺血缺氧性危害[13，14]。生理状态下的NO具有按捺白细胞与血管内皮粘附、按捺血小板凝聚、调理内皮素的排泄水平、避免血管缩短痉挛及血栓构成、保持心脏等重要器官的血液灌注等效果[15]。脓毒症及脓毒症休克时，机体在炎症介质、内毒素等影响下高表达iNOS，发作很多NO，发动机体内的硝化应激反响，对细胞发作毒性效果，构成肺安排等危害[15，16]。ET-1对血管平滑肌具有激烈耐久的缩短效果，能使机体各种血管发作缩短，尤其是心脏冠状动脉，其主要表达于内皮细胞。本研讨中SD大鼠CLP术后3 h血清NO和ET-1即显着升高，12 h到达最大值，分别为（123.5±4.2）μg/mL、（148.4±9.7）pg/mL，24 h稍有下降，但仍显着高于假手术组和正常组（P<0.01），而NO和ET-1比值呈下降趋势，每时点比值均显着低于正常组（P<0.05）。试验成果提示，内皮细胞在脓毒症状态下过度发作NO，高表达内皮素，且二者份额失衡，在脓毒症的发作开展进程中可能起到重要效果，尤其在心肌毒性、心肌缺血缺氧性危害中可能起要害效果；假如能够有用防治NO和ET-1的过度表达与开释，将二者调控在适宜份额，必然可能会减轻脓毒症脏器危害。凋亡的内皮细胞掉落后构成循环内皮细胞，其数量能够直接和特异地反映活体内血管危害状况[17]。本试验电镜下调查冠状动脉血管内皮细胞超微结构危害评分呈逐渐升高，内皮细胞呈现水肿，线粒体棘突消失、肿胀，核固缩、空泡样改动，并逐渐加剧，最终较多内皮细胞凋亡掉落至管腔内。内皮细胞凋亡、掉落，引起凝血功用紊乱，微循环妨碍，累及多体系和脏器，进而导致MODS发作，所以内皮细胞可能是寻觅脓毒症医治的重要靶细胞。
cTnI是较CK、CK-MB灵敏性和特异性更高的心肌细胞危害标志物，cTnI升高水平与脓毒症的严峻程度有关，继续性升高预示心功用妨碍和不良预后[18]。Cheng H等[19]经过对430例患者的研讨以为cTnI是严峻脓毒症及感染性休克患者强有力的猜测病死率的目标。本试验显现脓毒症大鼠前期就呈现cTnI增高，继续高于正常水平，提示脓毒症初期即存在显着的心肌细胞结构损坏，试验中透射电镜调查也证明脓毒症前期心肌细胞超微结构损坏显着，体现为肌原纤维距离变宽，溶解损坏逐渐加剧，线粒体呈现肿胀、棘突消失，结构含糊等，故而脓毒症前期采纳有用办法减轻心肌细胞危害尤为重要。本试验中cTnI水平在CLP术后C3达峰值[（1.489±0.260）ng/mL]，之后有所下降，与继续危害的心肌细胞超微结构有差异，cTnI非继续性升高可能与cTnI开释、降解动态平衡及耗竭有关[20]。LVSP、+dp/dt max、-dp/dt max是反映心肌缩短、舒张功用的灵敏目标。本试验显现LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max在CLP术后3 h即呈现显着下降，6 h时到达谷底，在12 h后有上升体现，提示脓毒症初期即存在心肌缩短、舒张功用反常，其可能是“可逆性”功用改动，所以临床上前期进行心肌维护医治可能对脓毒症患者预后有利[5]。电镜调查脓毒症时心肌超微结构危害呈逐渐加剧，而心肌力学并非继续下降，其机制尚不清晰，可能与神经内排泄负反馈调理、心肌按捺因子衰減、耗费、心肌线粒体诱生等要素有关[20]。
有研讨显现一些抗炎药物，如乌司他丁、血必净等在减轻内皮细胞活化、危害的一起可显着改进心肌功用，削减心肌细胞危害[21，22]。本试验成果显现，脓毒症前期血清NO、ET-1水平显着升高，且份额失调的一起，cTnI水平显着升高，心肌功用下降，透射电镜下调查到脓毒症前期冠状动脉血管内皮细胞危害的一起伴有心肌细胞危害，二者超微结构危害均呈进行性加剧，提示脓毒症状态下血管内皮细胞和心肌细胞危害可能相关，内皮细胞可能经过多途径参加心肌危害，如血管内皮细胞在毒素和失控性炎性细胞因子影响下诱导NO和ET-1很多表达和开释，高浓度的NO可对心肌细胞直接发作毒性效果，且二者份额失衡可引起血管痉挛缩短，引起缺血缺氧性心肌危害；凋亡的血管内皮细胞从基底膜掉落，构成胶原露出，发动内源性凝血机制，引起凝血功用紊乱、血小板集合、血栓构成，加剧心肌微循环妨碍；脓毒症状态下内皮细胞危害和活化，其外表过量表达的黏附分子、挑选素（如VCAM-1、E-挑选素等）诱导白细胞的趋化、黏赞同游走，游走至心肌安排的白细胞开释过量髓过氧化物酶、蛋白水解酶、炎性介质等有害物质可对心肌细胞构成直接危害。
综上，脓毒症前期即呈现显着心肌和血管内皮细胞危害，内皮细胞在心肌危害中可能扮演重要人物，其详细机制有待进一步深化研讨。
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（收稿日期：2017-10-08）
