雷盛钦+胡水婷+程丽+黄小燕
[摘要]意图 评论低剂量脂多糖（LPS）影响对哮喘小鼠T淋巴细胞发作IL-17的影响及其机制。办法 仿制哮喘小鼠模型，体外别离培育脾脏来历的T淋巴细胞，分为对照组和LPS组，其间LPS组又分为LPS1组和LPS2组，别离以1、2 ng/ml的LPS体外影响T细胞72 h。对照组以生理盐水代替LPS。选用ELISA法检测细胞培育上清液中的IL-17水平，调查IL-17的水平浓度改变。成果 以低剂量LPS影响哮喘小鼠T淋巴细胞后，其培育上清液中IL-17的水平较对照组显着下降，差异有统计学含义（P<0.01）。定论 低剂量LPS能够按捺哮喘T细胞IL-17的排泄，可能与机体的免疫耐受相关。
[关键词]脂多糖；哮喘小鼠；T细胞；白介素-17
[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）01（c）-0120-03
[Abstract]Objective To explore the influence of LPS with low dosage on the secretion of IL-17 and the potential mechanism.Methods The asthma mouse model was copied successfully and the T cells from spleen were isolated and cultured in vitro，and the mice were divided into the control group and the LPS group.The mice in LPS group were divided into the LPS group 1 and the LPS group 2，and were stimulated with 1，2 ng/ml LPS respectively for 72 hours.The control group was stimulated with the same volume of saline.The concentrations of IL-17 in the supernatant were detected with ELISA，the change of concentration of IL-17 was observed.Results After stimulation with lower dosages of LPS，the secretion of IL-17 in the supernatant decreased significantly in the LPS groups than that in the control group，with significant difference （P<0.01）.Conclusion Low dosage of LPS can inhibit the secretion of IL-17 in T cells of asthma，and it may be related with immune tolerance.
[Key words]Lipopolysaccharide；Asthma mice；T cell；Interleukin-17
支氣管哮喘是全球常见的缓慢疾病之一，是由T细胞、B细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞等多种炎症细胞和细胞因子参加的缓慢气道炎症性疾病[1-2]。T细胞及其亚群如Th2细胞排泄的细胞因子如白介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-5、IL-13、IL-17等直接参加了哮喘的炎症进程，进而诱发哮喘的一系列症状[3]。IL-17是一种首要由CD4+T淋巴细胞、嗜酸粒细胞等排泄的前炎性细胞因子，具有强壮的征集中性粒细胞及促进多种炎性因子开释的效果，参加了机体多种炎症性疾病的发作、开展[4-5]，在哮喘的缓慢气道炎症进程中，也发挥着重要的效果[6]。本试验使用低剂量脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在体外影响哮喘小鼠T细胞，检测其IL-17的发作状况，评论低剂量LPS诱导IL-17的发作及哮喘T淋巴细胞免疫耐受的可能机制。
1材料与办法
1.1首要试剂及仪器
RPMI 1640培育基、胎牛血清（Hyclone公司），Al（OH）3（A8222，Sigma公司），鸡卵清蛋白（A5503，Sigma公司），尼龙毛柱（Cat.146-04231，日本Wako公司），小鼠红细胞裂解液（碧云天公司），小鼠IL-17 ELISA试剂盒（Diaclone公司），倒置显微镜（日本Nikon），Eppendorf离心机，流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），雾化器（boyo37G6000型，德国百瑞公司），空气压缩泵（德国百瑞公司）。
1.2试验动物与分组
BALB/c小鼠15只，清洁级，4～6周龄，体重20～30 g，男女不限，随机分为两组，对照组5只，LPS组10只，其间LPS组又分为LPS1组和LPS2组，各5只。小鼠购自温州医学院试验动物中心，在一般清洁条件下养殖，自在取水、摄食。
1.3哮喘小鼠模型的制造
10只LPS组小鼠别离于第1、14天致敏，即经小鼠腹腔打针OVA 10 μg与Al（OH）3凝胶20 mg的混合液，总体积200 μl；第25天开端，将小鼠放置于容积为5 L的密闭容器中，经过衔接雾化吸入器的空气压缩泵，以3%的OVA气溶胶激起小鼠，30 min/次，1次/d，一共3次。5只正常对照组小鼠以等量的生理盐水代替OVA致敏及激起。最终1次激起后48 h处死小鼠，搜集标本。
1.4 T细胞的体外别离培育
无菌状况下别离切除各组小鼠脾脏，剪碎过100目钢网，搜集细胞混悬液，过T细胞尼龙毛柱，放置于37℃，5%CO2培育箱中孵育1 h，再用RPMI 1640冲刷尼龙毛柱，即得到别离、纯化的T细胞。流式细胞仪检测CD3，检测T细胞纯度。按试验要求从头调整T细胞浓度为1×106/ml。
1.5 LPS体外影响T细胞
取24孔培育板，每孔参加哮喘小鼠脾脏来历的T细胞1×106/ml（共1 ml），再别离参加终浓度为1、2 ng/ml的LPS生理盐水溶液，对照组以0.1 ml生理盐水代替参加。以上各组均设20个复孔。置培育板于5% CO2、37℃细胞培育箱中培育72 h后，取上清液测其IL-17水平。
1.6 ELISA法测定IL-17水平
依照说明书进程进行。加100 μl规范对照、待测样品和空白对照（样品稀释液）到已包被好的培育板孔内，37℃孵育90 min；洗板，每孔参加50 μl抗体，混合30 s，37℃孵育60 min；洗板，每孔参加50 μl抗体，混合30 s，37℃孵育60 min；洗板，每孔参加50 μl抗体，混合30 s，37℃孵育60 min；洗板，用50 μl停止液停止显色，10 min内用酶标仪在450 nm波利益测定光密度值。
1.7统计学处理
选用SPSS 11.5统计学软件对数据进行剖析，计量材料以x±s表明，不同组别间数据比较选用单要素方差剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1 T细胞的培育和判定
流式细胞仪检测总T细胞特异性外表标志物CD3，成果如图1所示，经尼龙毛柱法剖析取得的T细胞的纯度为70.6%，能够满意本次试验的需求。
2.2低剂量LPS对T细胞排泄IL-17的影响
对照组的IL-17水平为（10.48±1.47）pg/ml，LPS1组的IL-17水平为（9.34±1.63）pg/ml，LPS2组的IL-17水平为（9.57±1.66）pg/ml。与对照组比较，低剂量LPS（LPS1组、LPS2组）影响哮喘T淋巴细胞后，其细胞培育上清液中的IL-17水平下降，差异有统计学含义（P<0.01）。
3评论
支气管哮喘的发病机制杂乱，多种免疫细胞及细胞因子参加了其间的病理进程[7]，其间T细胞及其亚群发挥非常重要的效果，是形成哮喘炎症反响和各种临床症状的本源[8-9]。T细胞在抗原肽、首要安排相容性复合物分子的相互效果下，被抗原提呈细胞活化，然后增殖、分解成各种效应T细胞，别离排泄相应的细胞因子发挥各种功用[10]。
近年来有学者提出哮喘免疫调理机制的“卫生假说”，其间心是Th1/Th2细胞因子的平衡学说。该学说以为，哮喘的发作是Th2细胞过度活化，开释较多的Th2细胞因子，而Th1细胞因子表达缺乏使Th1/Th2平衡失调[11]。依据此理论，当哮喘小鼠模型建成后，其血清中与Th2细胞相关的细胞因子水平如IL-4、IL-5、IL-13、IL-17等应该上升，可是在本试验中，低剂量LPS影响哮喘小鼠T淋巴细胞后，其培育上清液中的IL-17水平下降，低于对照组，可能的机制是低剂量LPS短期影响可能按捺DC细胞的老练，然后阻断Th2细胞的活化，进而阻挠变态反响性疾病的发作、开展。莫碧云等[12]的研讨显现，LPS经过激活Toll样受体4在哮喘气道炎症和气道重塑进程中发挥双相调理效果，这与本课题研讨成果共同。
研讨显现，支气管哮喘患者肺安排中IL-17A+CD4+细胞添加，证明了Th17細胞群的存在，IL-17和Th17细胞在支气管哮喘的发病机制中发挥重要效果。Th17细胞及其排泄的IL-17A、IL-17F、IL-22均参加了支气管哮喘的发病。李贱等[13]的研讨成果显现，与健康对照组比较，哮喘患者中Th17细胞数量升高，其排泄的IL-17水平亦升高。进一步的研讨发现，与轻度、中度、重度哮喘比较，IL-17升高的水平与支气管哮喘的严峻程度成正比。涂国华等[14]的研讨显现，哮喘患者痰液中IL-17A和IL-8 mRNAs水平显着升高，提示Th17细胞以及IL-17A经过IL-8导致了哮喘中的中性粒细胞炎症。痰液中的IL-17A添加也与哮喘中支气管高反响性有关[15]。痰液中IL-17A添加也是重度哮喘的独立风险要素[16]。
气道上皮细胞排泄的IL-17能够促进淋巴细胞和巨噬细胞滋润以及黏液排泄添加。IL-17基因缄默沉静后，小鼠Th2细胞因子的发作显着添加，嗜酸粒细胞功用显着增强，提示Th17与Th2之间可能存在分解拮抗效果[17]。在IL-17宗族细胞因子中，IL-17A和IL-17F与哮喘严峻程度和肺部中性粒细胞征集的联系最亲近[18]。
在本试验中，与对照组比较，经低剂量LPS处理后T细胞没有发作显着的凋亡，其原因可能是LPS与T细胞在体外培育的时刻较短，T细胞没有发作凋亡，但T细胞处于对变应原不反响的状况，因而Th2细胞因子如IL-17等生成削减。
综上所述，低剂量LPS能够诱导哮喘免疫耐受，为哮喘的免疫治疗供给理论依据，可是其间详细的机制还有待愈加深化和全面的研讨。
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（收稿日期：2016-11-12 本文修改：祁海文）
