李萍 彭昕
[摘要] 意图 评论三叶青提取物对体外培育的人宫颈癌Hela细胞诱导凋亡的效果。 办法 四氮噻唑蓝（MTT）法检测三叶青提取物对Hela细胞的按捺增殖效果及其时效、量效联系；倒置显微镜下调查细胞形状学改动。成果 跟着三叶青提取物浓度升高，效果时刻的延伸，其对Hela细胞的增殖按捺率逐步增强，与对照组比较有显着差异（P<0.05），Hela细胞形状呈现显着的凋亡特征性改动。 定论 三叶青提取物对人宫颈癌Hela 细胞具有显着的体外细胞毒效果，其毒性效果与药物的浓度和效果时刻呈显着正相关。
[关键词] 三叶青；Hela细胞；诱导凋亡；MTT法
[中图分类号] R73-36； R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）23-0004-03
[Abstract] Objective To study the effect of extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg on the proliferation of human cervical cancer Hela cells. Methods MTT assay was used to determine the inhibitory rate of the extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg on the proliferation of HeLa cells. The morphology of cell apoptosis was observed by inverted microscope. Results The inhibition ratio of tumor cell was gradually increased with the longer extension time or the increase of dosages of the extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg the treatment groups was significant differentce（P<0.05） compared with the control group. Under inverted microscope， the tumor cells showed a special phenomenon of cellular apoptosis. Conclusion The extracts of tetrastigma hemsleyanum diels et gilg has a significant toxicological effect on human cervical cancer Hela cells， which positively relates with its concentration and effect time.
[Key words] Tetrastigma hemsleyanum diels et gilg； Hela cells； Apoptosis-inducing； MTT assay
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤， 发病率在女人恶性肿瘤中居第二位[1]。现在临床医治运用的化疗药物多有较强的毒副效果和耐药性问题，从传统中药中寻觅高效、低毒的抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物新药开发的抢手课题[2]。三叶青是我国浙江、江西、广西等少部分区域独有的珍稀中药种类[3]，可用于医治肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病，也是抗肿瘤常用药物[4，5]。有研讨发现三叶青总黄酮能显着地按捺肝癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的成长，且细胞有显着的凋亡特征性改动[6-9]。本研讨首要评论三叶青提取物对宫颈癌Hela细胞的体外细胞毒效果，为其临床应用于宫颈癌医治供给科学根据。
1 资料与办法
1.1 仪器及试剂
MTT 购于Sigma公司；RPMI-1640培育液、胰蛋白酶、胎牛血清购于Gibco公司；HF/60W二氧化碳培育箱，由香港Hecnforce公司出产；OLYMPUS（IX50-S8F2）倒置显微镜，酶标仪（类型XMARK）由美国BIO-RAD出产。
1.2 三叶青提取物制备
三叶青药材购自宁波鄞州医药药材公司，称取三叶青药材1000 g，选用碱性稀醇浸提，酸化沉淀法[9]得三叶青提取物6.9 g。
1.3细胞株及细胞培育
人宫颈癌Hela细胞株购自上海中科院细胞生化所，接种于含10%胎牛血清、青霉素、链霉素各100 mg/L的RPMI1640培育基中，置于37℃饱和湿度，含5%CO2的细胞培育箱培育，当Hela细胞长满瓶壁80%以上时，参加0.25%的胰蛋白酶消化，制成1×105/mL细胞悬液。
1.4试验分组及药物处理
试验分为加药组和对照组（不含药物，加等体积培育液），加药组每孔参加不同浓度的三叶青提取物，终浓度别离为1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL、16 mg/mL，每组5个复孔。
1.5 四氮噻唑蓝（MTT）比色法
根据参考文献[10，11]办法取对数成长期Hela细胞，接种于96孔板，每孔参加100 μL细胞悬液，培育过夜，待细胞贴壁后，参加各浓度的药液100 μL。对照组加100 μL的培育液，培育24 h或48 h后，弃上清液，在各孔中参加向每孔参加MTT储液50 μL（5 mg/mL），震动混匀后，持续培育4 h当心吸除各孔培育液，每孔参加DMSO 200 μL，振荡器上震动溶解10 min，空白调零，用酶标仪测波长570 nm处各孔吸光度，按公式细胞增殖按捺率（IR）=（1-A 加药组的平均值/A对照组的平均值）×100%计算出细胞增殖按捺率。
1.6光学显微镜下形状学调查
取处于对数成长期的Hela细胞，5个不同浓度药物（同MTT）别离处理，并设不加药物只加等量培育液的为对照组细胞，别离于倒置显微镜下调查细胞并照相，比较加药组和对照组Hela细胞的形状改动。
1.7计算学处理
选用SPSS 13.0计算软件进行计算学处理，试验数据以均数±标准差（x±s）标明，组间及组内比较选用方差剖析（F查验），P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1细胞增殖按捺率成果及方差剖析
由表1可见跟着三叶青提取物浓度的增大，处理时刻的延伸，Hela细胞OD值逐步削减，标明其对Hela细胞成长的按捺效果跟着浓度的增大，处理时刻的添加而加强。与对照组比较，除了1mg/mL药物处理24 h组外，其他各药物处理组的OD值均显着低于对照组（P<0.05）。标明三叶青提取物浓度本试验所选用的浓度规模之内对Hela细胞的按捺效果有显着的剂量及时刻依靠。经不同浓度三叶青提取物效果后的各组Hela细胞，细胞增殖按捺率成果及方差剖析成果如表2、3所示。
3 评论
宫颈癌是损害女人健康的生殖系统最常见的恶性肿瘤，每年全球约有20多万女人死于宫颈癌。现在临床多选用以手术和放疗为主、化疗为辅的医治计划，但惯例放化疗对肝、肾等器官的毒副效果大，且易发生多药耐药性，医治效果不尽善尽美[13]。寻觅效果好一起毒副效果较小的天然药物有重要的临床含义。近年来中药诱导凋亡已成为肿瘤研讨范畴的一个新热门，不少学者以体外细胞株为研讨目标发现中药可经过影响细胞周期、改动细胞凋亡基因及蛋白的表达或相关酶的活性等途径来有用按捺肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡[14]。三叶青为浙江省地方性传统中药，最近因其被发现具有抗多种肿瘤的生物活性而被广泛重视。有报导显现[15]，三叶青提取物与肺癌 A549细胞共培育48 h，其细胞活性显着性下降，且DNA 琼脂糖凝胶电泳呈现“梯状”条带，是细胞凋亡的一个重要标志。汪珍等[8]调查三叶青提取物对人结肠癌RKO细胞的影响，成果显现：三叶青提取物能显着地按捺人结肠癌细胞系RKO细胞的成长，并能下调 Bcl-XL、上调Bid来诱导凋亡，具有浓度依靠性。冯正权等[16]经过体外培育人胃癌SGC-7901细胞，检测三叶青黄酮对其成长的按捺效果，成果标明：三叶青黄酮能显着按捺 SGC-7901细胞增殖，具有浓度依靠性，且细胞周期剖析显现有显着的凋亡峰呈现，并能下降细胞上清液中基质金属蛋白酶-2的含量。此外，三叶青提取物可以改进荷瘤小鼠机体的细胞免疫功用，激活机体的抗氧化效果途径，具有必定的体内抑瘤效果，其高剂量干预后的抑瘤率达 36.06%[17]。
本研讨经过定量（MTT）和定性（显微镜观测）的办法，对5种不同浓度的三叶青的提取物效果后的Hela细胞凋亡特征性改动进行了研讨，发现试验所选用浓度规模内三叶青提取物均有按捺Hela细胞增殖效果，且呈浓度/时刻-效应正相关。关于增殖按捺率的点评一般以为[1]，<30%为不灵敏（耐药），>50%为灵敏，30%～50%为中度灵敏，由本试验检测成果可知，8 mg/mL的三叶青提取物效果24 h后对Hela细胞的成长即有中度灵敏的按捺效果（36.85%），且随其浓度的添加及效果时刻的延伸越灵敏。经过光学显微镜调查Hela细胞形状，可见细胞变圆、细胞核固缩、核碎裂及凋亡小体构成等凋亡形状，跟着浓度的添加该特征越显着。因而，本研讨成果显现三叶青提取物对Hela细胞具有很好的肿瘤细胞毒效果，是很有潜力的抗宫颈癌药物。但本研讨中的办法仅为开始调查细胞凋亡的目标[18]，本课题组拟进一步经过DNA琼脂糖凝胶电泳检测法定性剖析凋亡细胞的DNA裂解，经过流式细胞仪定量剖析三叶青效果后的细胞凋亡率及其细胞周期改动，并检测三叶青提取物效果后凋亡相关基因表达的改动以清晰其促凋亡的分子机制，为开发研发宫颈癌医治的新候选药物进一步供给牢靠的理论和试验根据。
[参考文献]
[1] 张丽云. 柴胡、苦参、大黄、黄柏对人宫颈癌细胞按捺效果的研讨[D]. 我国农业科学院，2011.
[2] 戴焱焱，黄才国，陈若华. 天然提取物诱导人 HepG2 细胞凋亡的研讨发展[J]. 现代生物医学发展，2012，12（20）：3962-3965.
[3] 韦树根，董青松，韦莹，等. 广西濒危珍稀中药材三叶青资源调查研讨[J]. 北方园艺，2011，21：162-164.
[4] 彭昕，张剑，何军邀，等. 三叶青松懈型和细密型愈伤安排悬浮培育及黄酮堆集的比较研讨[J]. 中草药，2012， 43（3）：577-580.
[5] 彭昕，汪荣斌，何军邀，等. 三叶青颗粒状愈伤安排悬浮培育系的树立及培育条件的优化[J]. 中成药，2012，34（5）：961-964.
[6] 张立明，樊瑞军，杨凤琴. 三叶青黄酮诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡的试验研讨[J]. 时珍国医国药，2010，21（11）：2850-2851.
[7] 刘跃银，夏红. 三叶青乙酸乙酯提取物诱导人结肠癌 HT-29 细胞凋亡[J]. 湖南师范大学学报（医学版），2010，7（4）：22-28.
[8] 汪珍，冯健，王晓华. 三叶青提取物对人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡的影响[J]. 浙江中医药大学学报，2008， 32（3）：321-323.
[9] 王小莉，曾娟，周辉. 三叶青提取物对肺癌细胞株A549的影响[J]. 肿瘤药学，2012，2（5）：347-349.
[10] 刘旭. 虎眼万年青总皂苷对乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响及机制研讨[D]. 南京中医药大学，2012.
[11] 徐吉敏，张世安，黄艳. MTT法研讨酸枣仁皂苷A对肝细胞——肝星状细胞和肝癌细胞增殖的影响[J]. 西北药学杂志，2013，28（3）：281-284.
[12] 刘秀萍. 丹参制剂对宫颈癌Hela细胞成长增殖及其相关调控分子表达影响的体外试验研讨[D]. 河北医科大学，2010.
[13] 陈秀玮. 白桦脂酸诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡及机制的研讨[D]. 黑龙江中医药大学，2012.
[14] 康丽娜. 中药诱导肿瘤细胞凋亡研讨发展[J]. 医学信息，2011，7：3168-3169.
[15] 程伟，陆曙梅. 三叶青提取物对肺癌 A549 细胞的体外按捺效果[J]. 我国试验方剂学杂志，2007，13 （10）：53-56.
[16] 冯正权，倪克锋，何煜，等. 三叶青黄酮诱导 SGC-7901胃癌细胞凋亡的试验研讨[J]. 我国临床药理学与医治学，2006，11（6）：669-672.
[17] 徐彩菊，白宁宁，孟佳，等. 三叶青提取物体内抑瘤效果及其机理研讨[J]. 我国卫生查验杂志，2009，19（2）：278-280.
[18] 张广智，胡长敏，陈颖钰，等. 细胞凋亡的首要检测办法研讨发展[J]. 动物医学发展，2011，32（8）：89-92.
（收稿日期：2014-02-27）
1.6光学显微镜下形状学调查
取处于对数成长期的Hela细胞，5个不同浓度药物（同MTT）别离处理，并设不加药物只加等量培育液的为对照组细胞，别离于倒置显微镜下调查细胞并照相，比较加药组和对照组Hela细胞的形状改动。
1.7计算学处理
选用SPSS 13.0计算软件进行计算学处理，试验数据以均数±标准差（x±s）标明，组间及组内比较选用方差剖析（F查验），P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1细胞增殖按捺率成果及方差剖析
由表1可见跟着三叶青提取物浓度的增大，处理时刻的延伸，Hela细胞OD值逐步削减，标明其对Hela细胞成长的按捺效果跟着浓度的增大，处理时刻的添加而加强。与对照组比较，除了1mg/mL药物处理24 h组外，其他各药物处理组的OD值均显着低于对照组（P<0.05）。标明三叶青提取物浓度本试验所选用的浓度规模之内对Hela细胞的按捺效果有显着的剂量及时刻依靠。经不同浓度三叶青提取物效果后的各组Hela细胞，细胞增殖按捺率成果及方差剖析成果如表2、3所示。
3 评论
宫颈癌是损害女人健康的生殖系统最常见的恶性肿瘤，每年全球约有20多万女人死于宫颈癌。现在临床多选用以手术和放疗为主、化疗为辅的医治计划，但惯例放化疗对肝、肾等器官的毒副效果大，且易发生多药耐药性，医治效果不尽善尽美[13]。寻觅效果好一起毒副效果较小的天然药物有重要的临床含义。近年来中药诱导凋亡已成为肿瘤研讨范畴的一个新热门，不少学者以体外细胞株为研讨目标发现中药可经过影响细胞周期、改动细胞凋亡基因及蛋白的表达或相关酶的活性等途径来有用按捺肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡[14]。三叶青为浙江省地方性传统中药，最近因其被发现具有抗多种肿瘤的生物活性而被广泛重视。有报导显现[15]，三叶青提取物与肺癌 A549细胞共培育48 h，其细胞活性显着性下降，且DNA 琼脂糖凝胶电泳呈现“梯状”条带，是细胞凋亡的一个重要标志。汪珍等[8]调查三叶青提取物对人结肠癌RKO细胞的影响，成果显现：三叶青提取物能显着地按捺人结肠癌细胞系RKO细胞的成长，并能下调 Bcl-XL、上调Bid来诱导凋亡，具有浓度依靠性。冯正权等[16]经过体外培育人胃癌SGC-7901细胞，检测三叶青黄酮对其成长的按捺效果，成果标明：三叶青黄酮能显着按捺 SGC-7901细胞增殖，具有浓度依靠性，且细胞周期剖析显现有显着的凋亡峰呈现，并能下降细胞上清液中基质金属蛋白酶-2的含量。此外，三叶青提取物可以改进荷瘤小鼠机体的细胞免疫功用，激活机体的抗氧化效果途径，具有必定的体内抑瘤效果，其高剂量干预后的抑瘤率达 36.06%[17]。
本研讨经过定量（MTT）和定性（显微镜观测）的办法，对5种不同浓度的三叶青的提取物效果后的Hela细胞凋亡特征性改动进行了研讨，发现试验所选用浓度规模内三叶青提取物均有按捺Hela细胞增殖效果，且呈浓度/时刻-效应正相关。关于增殖按捺率的点评一般以为[1]，<30%为不灵敏（耐药），>50%为灵敏，30%～50%为中度灵敏，由本试验检测成果可知，8 mg/mL的三叶青提取物效果24 h后对Hela细胞的成长即有中度灵敏的按捺效果（36.85%），且随其浓度的添加及效果时刻的延伸越灵敏。经过光学显微镜调查Hela细胞形状，可见细胞变圆、细胞核固缩、核碎裂及凋亡小体构成等凋亡形状，跟着浓度的添加该特征越显着。因而，本研讨成果显现三叶青提取物对Hela细胞具有很好的肿瘤细胞毒效果，是很有潜力的抗宫颈癌药物。但本研讨中的办法仅为开始调查细胞凋亡的目标[18]，本课题组拟进一步经过DNA琼脂糖凝胶电泳检测法定性剖析凋亡细胞的DNA裂解，经过流式细胞仪定量剖析三叶青效果后的细胞凋亡率及其细胞周期改动，并检测三叶青提取物效果后凋亡相关基因表达的改动以清晰其促凋亡的分子机制，为开发研发宫颈癌医治的新候选药物进一步供给牢靠的理论和试验根据。
[参考文献]
[1] 张丽云. 柴胡、苦参、大黄、黄柏对人宫颈癌细胞按捺效果的研讨[D]. 我国农业科学院，2011.
[2] 戴焱焱，黄才国，陈若华. 天然提取物诱导人 HepG2 细胞凋亡的研讨发展[J]. 现代生物医学发展，2012，12（20）：3962-3965.
[3] 韦树根，董青松，韦莹，等. 广西濒危珍稀中药材三叶青资源调查研讨[J]. 北方园艺，2011，21：162-164.
[4] 彭昕，张剑，何军邀，等. 三叶青松懈型和细密型愈伤安排悬浮培育及黄酮堆集的比较研讨[J]. 中草药，2012， 43（3）：577-580.
[5] 彭昕，汪荣斌，何军邀，等. 三叶青颗粒状愈伤安排悬浮培育系的树立及培育条件的优化[J]. 中成药，2012，34（5）：961-964.
[6] 张立明，樊瑞军，杨凤琴. 三叶青黄酮诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡的试验研讨[J]. 时珍国医国药，2010，21（11）：2850-2851.
[7] 刘跃银，夏红. 三叶青乙酸乙酯提取物诱导人结肠癌 HT-29 细胞凋亡[J]. 湖南师范大学学报（医学版），2010，7（4）：22-28.
[8] 汪珍，冯健，王晓华. 三叶青提取物对人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡的影响[J]. 浙江中医药大学学报，2008， 32（3）：321-323.
[9] 王小莉，曾娟，周辉. 三叶青提取物对肺癌细胞株A549的影响[J]. 肿瘤药学，2012，2（5）：347-349.
[10] 刘旭. 虎眼万年青总皂苷对乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响及机制研讨[D]. 南京中医药大学，2012.
[11] 徐吉敏，张世安，黄艳. MTT法研讨酸枣仁皂苷A对肝细胞——肝星状细胞和肝癌细胞增殖的影响[J]. 西北药学杂志，2013，28（3）：281-284.
[12] 刘秀萍. 丹参制剂对宫颈癌Hela细胞成长增殖及其相关调控分子表达影响的体外试验研讨[D]. 河北医科大学，2010.
[13] 陈秀玮. 白桦脂酸诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡及机制的研讨[D]. 黑龙江中医药大学，2012.
[14] 康丽娜. 中药诱导肿瘤细胞凋亡研讨发展[J]. 医学信息，2011，7：3168-3169.
[15] 程伟，陆曙梅. 三叶青提取物对肺癌 A549 细胞的体外按捺效果[J]. 我国试验方剂学杂志，2007，13 （10）：53-56.
[16] 冯正权，倪克锋，何煜，等. 三叶青黄酮诱导 SGC-7901胃癌细胞凋亡的试验研讨[J]. 我国临床药理学与医治学，2006，11（6）：669-672.
[17] 徐彩菊，白宁宁，孟佳，等. 三叶青提取物体内抑瘤效果及其机理研讨[J]. 我国卫生查验杂志，2009，19（2）：278-280.
[18] 张广智，胡长敏，陈颖钰，等. 细胞凋亡的首要检测办法研讨发展[J]. 动物医学发展，2011，32（8）：89-92.
（收稿日期：2014-02-27）
1.6光学显微镜下形状学调查
取处于对数成长期的Hela细胞，5个不同浓度药物（同MTT）别离处理，并设不加药物只加等量培育液的为对照组细胞，别离于倒置显微镜下调查细胞并照相，比较加药组和对照组Hela细胞的形状改动。
1.7计算学处理
选用SPSS 13.0计算软件进行计算学处理，试验数据以均数±标准差（x±s）标明，组间及组内比较选用方差剖析（F查验），P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1细胞增殖按捺率成果及方差剖析
由表1可见跟着三叶青提取物浓度的增大，处理时刻的延伸，Hela细胞OD值逐步削减，标明其对Hela细胞成长的按捺效果跟着浓度的增大，处理时刻的添加而加强。与对照组比较，除了1mg/mL药物处理24 h组外，其他各药物处理组的OD值均显着低于对照组（P<0.05）。标明三叶青提取物浓度本试验所选用的浓度规模之内对Hela细胞的按捺效果有显着的剂量及时刻依靠。经不同浓度三叶青提取物效果后的各组Hela细胞，细胞增殖按捺率成果及方差剖析成果如表2、3所示。
3 评论
宫颈癌是损害女人健康的生殖系统最常见的恶性肿瘤，每年全球约有20多万女人死于宫颈癌。现在临床多选用以手术和放疗为主、化疗为辅的医治计划，但惯例放化疗对肝、肾等器官的毒副效果大，且易发生多药耐药性，医治效果不尽善尽美[13]。寻觅效果好一起毒副效果较小的天然药物有重要的临床含义。近年来中药诱导凋亡已成为肿瘤研讨范畴的一个新热门，不少学者以体外细胞株为研讨目标发现中药可经过影响细胞周期、改动细胞凋亡基因及蛋白的表达或相关酶的活性等途径来有用按捺肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡[14]。三叶青为浙江省地方性传统中药，最近因其被发现具有抗多种肿瘤的生物活性而被广泛重视。有报导显现[15]，三叶青提取物与肺癌 A549细胞共培育48 h，其细胞活性显着性下降，且DNA 琼脂糖凝胶电泳呈现“梯状”条带，是细胞凋亡的一个重要标志。汪珍等[8]调查三叶青提取物对人结肠癌RKO细胞的影响，成果显现：三叶青提取物能显着地按捺人结肠癌细胞系RKO细胞的成长，并能下调 Bcl-XL、上调Bid来诱导凋亡，具有浓度依靠性。冯正权等[16]经过体外培育人胃癌SGC-7901细胞，检测三叶青黄酮对其成长的按捺效果，成果标明：三叶青黄酮能显着按捺 SGC-7901细胞增殖，具有浓度依靠性，且细胞周期剖析显现有显着的凋亡峰呈现，并能下降细胞上清液中基质金属蛋白酶-2的含量。此外，三叶青提取物可以改进荷瘤小鼠机体的细胞免疫功用，激活机体的抗氧化效果途径，具有必定的体内抑瘤效果，其高剂量干预后的抑瘤率达 36.06%[17]。
本研讨经过定量（MTT）和定性（显微镜观测）的办法，对5种不同浓度的三叶青的提取物效果后的Hela细胞凋亡特征性改动进行了研讨，发现试验所选用浓度规模内三叶青提取物均有按捺Hela细胞增殖效果，且呈浓度/时刻-效应正相关。关于增殖按捺率的点评一般以为[1]，<30%为不灵敏（耐药），>50%为灵敏，30%～50%为中度灵敏，由本试验检测成果可知，8 mg/mL的三叶青提取物效果24 h后对Hela细胞的成长即有中度灵敏的按捺效果（36.85%），且随其浓度的添加及效果时刻的延伸越灵敏。经过光学显微镜调查Hela细胞形状，可见细胞变圆、细胞核固缩、核碎裂及凋亡小体构成等凋亡形状，跟着浓度的添加该特征越显着。因而，本研讨成果显现三叶青提取物对Hela细胞具有很好的肿瘤细胞毒效果，是很有潜力的抗宫颈癌药物。但本研讨中的办法仅为开始调查细胞凋亡的目标[18]，本课题组拟进一步经过DNA琼脂糖凝胶电泳检测法定性剖析凋亡细胞的DNA裂解，经过流式细胞仪定量剖析三叶青效果后的细胞凋亡率及其细胞周期改动，并检测三叶青提取物效果后凋亡相关基因表达的改动以清晰其促凋亡的分子机制，为开发研发宫颈癌医治的新候选药物进一步供给牢靠的理论和试验根据。
[参考文献]
[1] 张丽云. 柴胡、苦参、大黄、黄柏对人宫颈癌细胞按捺效果的研讨[D]. 我国农业科学院，2011.
[2] 戴焱焱，黄才国，陈若华. 天然提取物诱导人 HepG2 细胞凋亡的研讨发展[J]. 现代生物医学发展，2012，12（20）：3962-3965.
[3] 韦树根，董青松，韦莹，等. 广西濒危珍稀中药材三叶青资源调查研讨[J]. 北方园艺，2011，21：162-164.
[4] 彭昕，张剑，何军邀，等. 三叶青松懈型和细密型愈伤安排悬浮培育及黄酮堆集的比较研讨[J]. 中草药，2012， 43（3）：577-580.
[5] 彭昕，汪荣斌，何军邀，等. 三叶青颗粒状愈伤安排悬浮培育系的树立及培育条件的优化[J]. 中成药，2012，34（5）：961-964.
[6] 张立明，樊瑞军，杨凤琴. 三叶青黄酮诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡的试验研讨[J]. 时珍国医国药，2010，21（11）：2850-2851.
[7] 刘跃银，夏红. 三叶青乙酸乙酯提取物诱导人结肠癌 HT-29 细胞凋亡[J]. 湖南师范大学学报（医学版），2010，7（4）：22-28.
[8] 汪珍，冯健，王晓华. 三叶青提取物对人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡的影响[J]. 浙江中医药大学学报，2008， 32（3）：321-323.
[9] 王小莉，曾娟，周辉. 三叶青提取物对肺癌细胞株A549的影响[J]. 肿瘤药学，2012，2（5）：347-349.
[10] 刘旭. 虎眼万年青总皂苷对乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响及机制研讨[D]. 南京中医药大学，2012.
[11] 徐吉敏，张世安，黄艳. MTT法研讨酸枣仁皂苷A对肝细胞——肝星状细胞和肝癌细胞增殖的影响[J]. 西北药学杂志，2013，28（3）：281-284.
[12] 刘秀萍. 丹参制剂对宫颈癌Hela细胞成长增殖及其相关调控分子表达影响的体外试验研讨[D]. 河北医科大学，2010.
[13] 陈秀玮. 白桦脂酸诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡及机制的研讨[D]. 黑龙江中医药大学，2012.
[14] 康丽娜. 中药诱导肿瘤细胞凋亡研讨发展[J]. 医学信息，2011，7：3168-3169.
[15] 程伟，陆曙梅. 三叶青提取物对肺癌 A549 细胞的体外按捺效果[J]. 我国试验方剂学杂志，2007，13 （10）：53-56.
[16] 冯正权，倪克锋，何煜，等. 三叶青黄酮诱导 SGC-7901胃癌细胞凋亡的试验研讨[J]. 我国临床药理学与医治学，2006，11（6）：669-672.
[17] 徐彩菊，白宁宁，孟佳，等. 三叶青提取物体内抑瘤效果及其机理研讨[J]. 我国卫生查验杂志，2009，19（2）：278-280.
[18] 张广智，胡长敏，陈颖钰，等. 细胞凋亡的首要检测办法研讨发展[J]. 动物医学发展，2011，32（8）：89-92.
（收稿日期：2014-02-27）
