纳仁高娃+米焱+杜禹+沈艳+肖建新+吕东晨+艾丽雅+牛思琪
[摘要] 意图 调查P2X3受体在糖尿病神经病理性痛苦大鼠模型中的效果和含义。 办法 将40只SD大鼠随机分为造模组（n=30）和对照组（n=10）。依照60 mg/kg一次性腹腔打针链脲佐菌素（STZ）树立糖尿病大鼠模型。于STZ打针前和打针后第7、14、28天别离测定大鼠血糖、体重以及机械性痛阈的改动。造模组又均分为造模1周组、造模2周组、造模4周组三个亚组。在造模前及造模后1、2、4周使用von Frey hairs法测定大鼠机械痛阈，并经过Real-time法测定每个时刻点大鼠脊髓背根神经节（DRG）P2X3受体的表达水平。 成果 肉眼调查糖尿病大鼠毛色昏暗，尾静脉采血点愈合缓慢，每日饮水，饮食，尿量显着添加，体现契合糖尿病大鼠的临床特征。各模型组血糖浓度均>16.7 mmol/L，各模型组与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.01）。糖尿病大鼠体重较对照组同期大鼠增加缓慢，差异有统计学含义（P<0.01）。造模组机械痛阈在造模1周后显着下降（P<0.01），并继续至4周（P<0.01）；在造模1周后脊髓DRG内P2X3受体表达水平呈现显着上调（P<0.01）。大鼠P2X3受体表达水平改动与机械痛阈的下降存在相关性。 定论 糖尿病前期大鼠脊髓DRG P2X3受体表达即呈现上调，并与痛苦相关，阐明P2X3受体可能在糖尿病大鼠周围神经痛苦的发作及痛敏的保持阶段起重要效果。
[关键词] 糖尿病；P2X3受体；背根神经节；Real-time法；大鼠
[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）12（c）-0004-04
糖尿病的发病率跟着生活水平的进步不断上升，严重损害人们的健康，神经病理性痛苦是现在损害糖尿病患者的首要缓慢并发症之一，临床体现为感觉反常和痛苦，其间对机械影响体现反常痛苦，称为痛性糖尿病周围神经病，因为机制尚不清晰，很难医治或无法治好[1-5]。P2X3受体的根本结构归于配体门控离子通道，P2X3受体亚基开始由脊髓背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）分离出来[6-7]。神经损害后安排开释很多ATP，一方面激活突触后膜P2X3受体，使细胞膜去极化，Ca2+内流，介导快速突触传递；另一方面激活突触前膜P2X3受体，促进谷氨酸开释[8]，经过NMDA和非NMDA系统，介导痛苦信息。本研讨旨在树立糖尿病神经病理性痛苦大鼠模型，讨论P2X3受体在其疾病开展过程中的效果，为临床医治供给根据。
1 材料与办法
1.1 糖尿病神经病理性痛苦大鼠模型的制备及分组
健康成年雄性SD大鼠，体重180～220 g，将其随机分为造模组（n=30）和对照组（n=10），造模组依照不同时刻点分为造模1周组、造模2周组、造模4周组，每组10只；使用世界通用的链脲佐菌素（Streptozocin，STZ，Sigma公司）腹腔打针树立糖尿病大鼠模型[9]。大鼠禁食水12 h后，腹腔一次性依照60 mg/kg剂量打针STZ，于打针后48 h，丈量尾静脉空腹血糖，假如血糖浓度>16.7 mmol/L，以为造模成功。对照组仅打针相同剂量蒸馏水。
1.2 血糖和体重测定
造模48 h后，使用血糖仪对一切大鼠进行尾静脉空腹血糖测定；于造模前及造模后1、2、4周进行体重测定。
1.3 痛行为学调查
于造模前和造模后1、2、4周对大鼠进行机械痛阈值的测定。固定时刻点（上午10：00～12：00），在固定的地址，室内环境尽可能安静舒适（室温保持在23℃左右，湿度55%左右）的情况下，给予人为机械影响，调查大鼠的痛行为改动。首要选用von Frey细丝法，不同标准的von Frey细丝（0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、1.0 g）笔直影响大鼠后足足心处，继续5～10 s，呈现显着缩足、舔足或抬足行为均视为阳性反响。影响强度从弱到强，重复10次，每距离3～5 min一次，10次中有6次以上阳性反响的最小影响强度视为机械性痛阈值。
1.4 Real-time调查P2X3受体蛋白表达
随机取不同组5只SD大鼠，乙醚麻醉后，获取L4～6 DRG神经元，置于冰上放置的玻璃研磨器中，参加1 ml的Trizol（Gibico公司），敏捷研磨至无肉眼可见安排块。5 min后将各组裂解液吸到1.5 ml RNase EP管中，参加氯仿0.2 ml/管，剧烈振摇15 s，静置2～5 min。4℃，12 000 r/min，离心10 min。离心后液体分为三层（上层——无色水样层为RNA，中层白色为蛋白质），当心汲取上层无色液体移入一个新的RNase EP管中，参加等体积异丙醇，上下颠倒混匀，静置10～30 min，离心（4℃，12 000 r/min，10 min）。弃去上清，沉积参加严寒75%乙醇1 ml，漂洗，用移液抢汲取液体，枯燥10～20 min，参加20 μl DEPC水溶解，分装，-80℃冰箱保存备用。RNA经逆转录反响组成cDNA，RT及PCR反响系统（Promega公司）按试剂盒阐明书进行。试验成果选用Real-time试验中方针基因的CT值经过GAPDH的CT值均一化，即ΔCT=CT方针-CTGAPDH，而方针基因mRNA相对丰度值以ΔΔCT值（DD value）表明，ΔΔCT=2-ΔCT。
P2X3引物序列为F：5′-CAACTTCAGGTTTGCCAA-3′；R：5′-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3′。
1.5 统计学剖析
选用SPSS 13.0统计学软件进行数据剖析，计量材料以x±s表明，选用单因素方差剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 调查
