项岳晖 卢玲玲 涂斐佩等
[摘要] 意图 选用杂交瘤技能制备糖化血红蛋白的单克隆抗体并对其进行判定，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒供给特异性资料。 办法 通过用顺丁烯二酰亚胺法制备免疫抗原，通过BALB/c小鼠进行多层次免疫，通过细胞培育交融，HAT培育基挑选杂交瘤细胞，运用G蛋白层析法、硫酸铵盐析法等对细胞进行纯化。单抗亚类判定选用小鼠单克隆抗体亚型判定试剂盒。 成果 通过细胞交融、培育、挑选、克隆等，终究挑选出1株能安稳排泄特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为N5B4；细胞培育上清液体效价为1∶5000，腹水效价为1∶100万；通过规范曲线核算样品中人糖化血红蛋白的浓度为99.2%。 定论 通过挑选取得高特异性、高灵敏度的KET单克隆抗体细胞株。
[关键词] 糖化血红蛋白；单克隆抗体；糖尿病黄斑水肿
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）11-0022-03
[Abstract] Objective Using hybridoma technique and screened hybridoma cell strains stably， efficiently secreted anti glycosylated hemoglobin monoclonal antibody to provide specific material for the development of glycosylated hemoglobin ELISA kit. Methods The immune antigen was prepared by maleimide method， multi-level immune mice by BALB/c， through cell culture fusion， screening of hybridoma cell culture medium HAT， ammonium sulfate salting out method and G protein chromatography. Monoclonal antibody subclasses were identified by monoclonal antibody subtype identification Kit operation. Results Through cell fusion， screening and cloning culture， etc.， the final selection screened 1 strain stably secreting specific antibody hybridoma cell line， named N5B4； cell culture supernatant liquid was 1∶5000， ascites titer was 1∶100 million； a standard curve to calculate the concentration in the sample human glycated hemoglobin was 99.2%. Conclusion After KET monoclonal antibody cell line to obtain a high specificity and high sensitivity of screening.
[Key words] Glycosylated hemoglobin； Monoclonal antibody； Diabetic macular edema
糖化血红蛋白（HbA1c）是一种非酶糖化产品，其对氧的亲和力显着高于正常的血红蛋白，血液中HbA1c水平增高会阻止氧在安排中分散，导致安排缺氧坏死。HbA1c水平增高也会加注重网膜缺氧状况，进一步加剧毛细血管扩张，渗漏显着添加，终究导致CSME加剧和医治作用欠安[1，2]。研讨标明，DME医治作用仅与HbA1c水平有关，血糖水平的凹凸对其无显着影响，这可能与HbA1c的水平反映测定前8～12周血糖的平均水平，血糖浓度的动摇对其影响不大，因而，是一项评价糖尿病操控作用的重要目标[3]。因而检测HbA1c的水平，关于临床医治糖尿病性黄斑水肿有极其重要的含义。本研讨运用杂交肿瘤技能制备并挑选出高特异性、高灵敏度的KET单克隆抗体细胞株，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒供给特异性资料，现报导如下。
1 资料与办法
1.1 一般资料
试验动物为BLAB/c小鼠20只，均购自上海中科院下属单位上海斯莱克试验动物中心，周龄8～10周，男女各10只。
1.2 办法
1.2.1 抗原制备 多肽链N结尾缬氨酸上的氨基与葡萄糖C1 发作糖基化。Cys（SH）用于偶联载体蛋白，用顺丁烯二酰亚胺法别离偶联KLH和BSA，制备出咱们所需求的免疫抗原。
1.2.2 动物免疫 取8～10周龄BALB/c小鼠20只，将免疫抗原选用多层次动物免疫办法进行免疫，交融前3 d进行1次强化免疫，添加剂量，不要运用佐剂。
1.2.3 细胞交融 细胞交融过程中应留意几个问题：①细胞的份额：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1∶2～1∶10不等。常用1∶4。②反应时刻。③培育液的成分。试验具体操作如下：将Sp2/o细胞和脾细胞混合，离心，取上清，悄悄摇散底部细胞，渐渐参加PEG（150%，0.7 mL）加完后敏捷参加25 mL不含血清的培育基以稀释PEG（37℃水浴进行），PEG能够构成细胞膜必定程度的损害，使细胞易于彼此黏连而交融在一起，800 rpm/min离心7 min，弃上清，参加HAT培育基，再加到含有养殖细胞的96孔板内，100 μL/孔，5%CO2、37℃培育。
1.2.4 杂交瘤细胞挑选及克隆化培育 选用直接ELISA法对交融后的细胞进行阳性杂交瘤细胞挑选，将挑选出来的细胞进一步运用有限稀释法进行克隆，然后进行扩展培育，搜集并冻存，对其进行判定。
1.2.5 单克隆抗体的制备及效价测定 挑选20只小鼠，运用1 mL打针器将0.5 mL液体白腊注入小鼠腹腔，培育1周后，将杂交瘤细胞打针进入小鼠腹腔，剂量为（1～2）×106个/只，1周后调查小鼠腹腔腹水生成状况，运用打针器抽取1～2 mL腹水，离心，取上清液。选用直接ELISA法测定效价，以A值大于阴性的2.1倍的稀释份额的倒数为该抗体效价，-20℃冻存腹水。
1.2.6 单克隆抗体的纯化及亚类判定 运用硫酸铵盐析法和G蛋白层析法对小鼠腹水进行纯化，依照小鼠单克隆抗体亚型试剂盒说明书进行操作判定。
1.3 统计学办法
运用SPSS21.0软件包对数据进行处理，计数资料选用χ2查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1细胞交融及挑选
通过细胞交融、培育、挑选、克隆等，终究挑选出1株能安稳排泄特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为N5B4。见表1。
2.2单抗的最大稀释度和腹水效价的测定
细胞培育上清液体效价为1∶5000，腹水效价为1∶100万。
2.3单克隆抗体判定
用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度OD值。通过规范曲线核算样品中人糖化血红蛋白的浓度为99.2%，不同浓度样品寄存-20℃放置3个月安稳性较高，见表2。
3 评论
HbA1c是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产品，在血液中的浓度与血糖浓度呈正比，且不能进行可逆性结合，其跟着红细胞消亡而消失，通过查看HbA1c能够评价采血前2～3个月血糖的平均水平。HbA1c与人体内的代谢有密切关系，当其浓度升高时，可影响红细胞对氧的亲和力，其与氧结合才能较强，简单引起安排与细胞缺氧，导致安排与毛细血管坏死，加快心脑血管并发症的构成。HbA1c浓度升高可引起肾小球增厚，引发糖尿病肾病。别的其还能引起血脂和血粘滞度增高，添加心血管疾病发作的危险。因而监测HbA1c在糖尿病患者病况操控、并发症猜测、糖尿病患者挑选等方面具有非常重要的作用。国际上现已清晰将HbA1c作为糖尿病监测的金规范，因为检测办法没有彻底一致，我国还未将其作为糖尿病的确诊规范。现在临床上对确诊的糖尿病患者进行HbA1c检测，首要意图在于了解患者近期血糖操控作用，为临床医治供给参阅。将HbA1c检测成果作为糖尿病病况操控的目标，对糖尿病高危人群展开HbA1c检测，能够前期发现糖尿病患者，并对其进行前期医治。
本研讨通过选用杂交瘤技能制备糖化血红蛋白的单克隆抗体并对其进行判定，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒供给特异性资料[4]。本试验所制备的1株糖化血红蛋白单克隆抗体具有较强的特异性，经腹水效价测定和竞赛ELISA法试验，成果提示本研讨制备挑选出来的HbA1c单克隆抗体具有较好的特异性和敏感性。
本研讨选用混合多层次免疫办法（快速免疫佐剂+“油包水”佐剂+脾脏增强），即第一次选用快速免疫佐剂维护免疫原并使抗原快速吸收[5]；第2次选用“油包水”免疫有利于抗原在体内存在时刻；第三次选用抗原直接打针脾脏，使短时刻内滴度到达最大作用。通过试验证明，选用混合多层次免疫具有极大的优势：①免疫周期短，与惯例免疫比较能够节约3～5周免疫时刻[5，6]；②抗原用量少，仅为传统免疫办法的1/3；③不损坏抗原天然构象，易取得针对天然构象的抗体；④抗体到达的滴度高，有利于得到高灵敏度的单克隆抗体细胞株[7，8]。本项目中通过克己抗原，选用混合多层次免疫办法进行动物免疫，通过杂交瘤交融、单克隆挑选、穿插按捺等等一系列试验[9，10]，得到的单克隆杂交瘤细胞株应及时冻存，以避免这些细胞的染色体丢掉，发作变异。通过很多的小鼠试验，咱们挑选了以甘油为诱导剂、细胞打针密度5×106为最佳的腹水出产计划[5-7，11]，得到的HbA1c单克隆抗体抗体灵敏度可达99%以上，特异性达98%以上。
总归，本课题制备特异性好、灵敏度高、安稳性好的糖化血红蛋白单克隆抗体，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒及其他检测办法供给特异性蛋白质料。
[参阅文献]
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（收稿日期：2014-10-15）
