张亚娟++++++田新瑞++++++常+++琴++++++王崇刚++++++董艳婷
[摘要] 意图 评论β-catenin蛋白敲除对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞（CCC-REPF-1）活性的影响及其机制。办法 体外培育大鼠肺成纤维细胞（CCC-REPF-1），使用CCK-8法、Western blot、 RT-PCR技能检测细胞增殖、活性及功用表达，进行统计学查验。 成果 TGF-β1影响组、 pcDNA3转染组CCK-8吸光度OD值、α-SMA和Fn 蛋白表达量、α-SMA 、colⅠ、colⅢmRNA表达量显着高于正常细胞组，而E-cadherin蛋白表达量显着低于正常细胞组；F-TrCP-Ecad转染组上述值显着低于TGF-β1影响组（P<0.01），E-cadherin蛋白表达量高于TGF-β1影响组 （P<0.01）；TGF-β1影响组、 pcDNA3转染组比较无显着差异。 定论 TGF-β1是促进肺成纤维细胞增殖、活化的重要细胞因子，β-catenin途径是TGF-β1 发挥效果的重要信号通路，β-catenin蛋白敲除经过阻断该信号途径，阻挠肺纤维化进程。
[关键词] β-catenin；TGF-β1；肺成纤维细胞；肺纤维化
[中图分类号] R563.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）21-0001-04
肺纤维化是呼吸系统疾病开展至晚期的一起病理改动，构成肺功用不可逆的损害，严重危害人类健康[1]。现在研讨以为，肺纤维化的根本病理进程包含前期弥漫性肺泡炎及后期很多间质细胞增生，发作基质胶原的进行性积累致使逐步替代正常的肺安排结构，严重影响肺的通气和换气功用[2-3]。在增生的细胞中，除肺泡上皮细胞和成肌细胞等外，成纤维细胞的增殖及活化并排泄基质胶原是纤维化构成的重要机制[4]。TGF-β1被以为是诱导肺成纤维细胞活化的最重要的细胞因子[5]，其效果的发挥与β-catenin途径高度相关[6]。本研讨经过调查β-catenin蛋白敲除对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的增殖及活性的影响，评论β-catenin蛋白敲除抗肺纤维化效果的细胞机制，为肺纤维化的医治供给新的思路。
1 材料与办法
1.1 首要试剂及物品
大鼠肺成纤维细胞（CCC-REPF-1），pcDNA3.0载体（Invitrogen），F-TrCP-Ecad载体（郑国平教授惠赠），Lipofectamine2000（Invitrogen），TGF-β1（PeproTech），抗E-cadherin，抗α -SMA，抗Fn（ SantaCruz），FITC标志的羊抗小鼠IgG（武汉博士德生物工程有限公司），胎牛血清（我国杭州四季青），高糖DMEM培育基（GIBCO），TRIzol总RNA提取试剂（武汉博士德生物工程有限公司），逆转录试剂盒（Promega），实时荧光定量试剂盒（上海生工生物工程技能服务有限公司），α-SMA引物、colⅠ引物、colⅢ引物、GAPDH引物（上海生工生物工程技能服务有限公司）。
1.2 肺成纤维细胞培育、传代及分组
在体外培育的大鼠肺成纤维细胞（CCC-REPF-1），用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的高糖DMEM培育基培育于5%的CO2，37℃人工培育箱中，细胞呈贴壁成长，进行传代培育。细胞分组，分为正常细胞组（A组）、TGF-β1影响组（B组）、pcDNA3转染组（C组）、F-TrCP-Ecad转染组（D组）。
1.3 pcDNA3及F-TrCP-Ecad转染CCC-REPF-1细胞
提取及纯化重组质粒DNA，测DNA 浓度备用。取对数期细胞消化，调整细胞数为2×105 cells/L，接种12孔板中，调查细胞成长至80%～90%时，弃培液，换无血清无双抗培育基800 μL，预备转染。100 μL无双抗、胎牛血清的培育基中参加4 ng 质粒，混合后置5 min，共6个EP管，3管为质粒pcDNA3，3管为质粒F-TrCP-Ecad，100 μL无双抗、胎牛血清的培育基中参加 4 μL Lipofectamine2000混合后置 5 min，6个EP管，将上述复合物混合后置20 min，弃12孔板6孔的培育基，用无双抗、胎牛血清的培育基清洗2次，加无双抗、胎牛血清的培育基800 μL，将上述复合物别离参加 6个孔，前后晃置4～6 h换正常培育基。转染6 h换新鲜培育基，各组别离参加TGF-β1（5 ng/mL），效果48 h。
1.4 CCK-8法检测肺成纤维细胞增殖
将各组细胞调整细胞浓度至5000个/100 μL， 以每孔100 μL接种于96孔板，每组复设8孔，每板每孔参加CCK-8 10 μL，5%CO2孵育箱内持续孵育1 h，分光光度计下测定450 nm波利益OD值。
1.5 Western 印迹检测细胞中E-cadherin、α-SMA、Fn的表达
取细胞用PBS洗刷后搬运到EP管，离心后弃上清，将收集到的细胞加细胞裂解液裂解1 h后，离心30 min，取上清，BCA蛋白质定量法测定蛋白浓度，取等量蛋白30 μL行SDS-PVDF凝胶电泳，转膜至PVDF膜，条件4 ℃ 2～5 h，5%脱脂牛奶关闭2 h。在4 ℃下小鼠抗大鼠E钙黏蛋白、α-SMA、纤维连接蛋白单克隆抗体（稀释为1∶200）与膜触摸孵育过夜，用洗膜缓冲液（TBST）在脱色摇床下洗膜5 min×5次，加羊抗小鼠IgG，室温下孵育2 h后，TBST洗膜，参加ECL在室温下反响5 min后成像，Taiphone扫描成果，选用Gene Snap/Gene Tool软件剖析以GAPDH蛋白为内参定量剖析E钙黏蛋白、α-SMA、纤维连接蛋白条带相对灰度值。
1.6 总RNA 抽提及实时荧光定量逆转录-聚合酶链反响（Real-timePCR）endprint
各组细胞每孔参加500 μL TRIzol Reagent，按试剂盒阐明提取总RNA及行RT-PCR检测α-SMA、colⅠ、col Ⅲ表达，GAPDH为内参。
GAPDH引物序列：上游引物5ˊ- GGTGCTGAGTATGTCGTGGAGT -3ˊ下流引物5ˊ- CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT -3，α -SMA上游引物5ˊ- AGCCAGTCGCCATCAGGAAC -3ˊ下流引物5ˊ- GGGAGCATCATCCCAGCAA-3ˊ，colⅠ：上游引物 5ˊ- GACATGTTCAGCTTTGTGTACCTC -3ˊ下流引物5ˊ- GGGACCCTTAGGCCATTGTGA -3ˊcol Ⅲ：上游引物5ˊ- TTTGGCACAGCAGTCCAATGTA -3ˊ下流引物5ˊ- GACAGATCCCGAGTTCGCAGA -3ˊ。PCR 反响系统条件： 95℃ 20 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s。40个循环。由随机顺便软件计算出Ct值和拷贝数。
1.7 统计学办法
计量材料选用均数±标准差表明，数据处理选用SPSS 19.0软件进行t查验或方差剖析，P <0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1 肺成纤维细胞光镜下调查
成纤维细胞呈梭型，有较长的突起，胞核呈卵圆形，坐落细胞中心，成放射状和栅门状摆放。TGF-β1影响后，细胞体积显着增大，胞突消失，细胞数量显着增多，细胞空隙变小。F-TrCP-Ecad转染组大部分细胞呈梭型，有较长的突起，细胞间有显着空隙。见图1。
A 正常细胞（倒置相差显微镜×200）
B TGF-β1 影响组（倒置相差显微镜×200）
C pcDNA3转染组（倒置相差显微镜×200）
D F-TrCP-Ecad转染组（倒置相差显微镜×200）
图1 肺成纤维细胞光镜下调查（×200）
2.2 CCK-8法调查各组肺成纤维细胞增殖
与正常组比较， TGF-β1影响组、pcDNA3转染组其OD值显着增高，但两组比较，无统计学差异；F-TrCP-Ecad转染组OD值较TGF-β1影响组显着减低（P<0.01），与正常组比较无统计学差异。见表1。
表1 CCK-8法丈量各组大鼠肺成纤维细胞增殖OD值（x±s，n=8）
注：与正常组比较，aP<0.01；与F-TrCP-Ecad转染组比较，bP<0.01；与TGF-β1 影响组比较，cP<0.01；与pcDNA3转染组比较，dP<0.01
2.3 Western印迹法检测各组细胞中α-SMA、Fn、E-cadherin的表达
与正常组比较， TGF-β1影响组、pcDNA3转染组其α -SMA、Fn 蛋白表达显着升高， E-cadherin表达显着下降（P<0.01），而两组比较无统计学差异；F-TrCP-Ecad转染组较TGF-β1影响组α -SMA、Fn 蛋白表达显着下降，E-cadherin表达显着升高（P<0.01），与正常组比较无统计学差异。见表2。
表2 各组大鼠肺安排中α-SMA、Fn 、E-cadherin蛋白表达（x±s，n=8）
注：与正常组比较，aP<0.01；与F-TrCP-Ecad转染组比较，bP<0.01；与TGF-β1 影响组比较，cP<0.01；与pcDNA3转染组比较，dP<0.01
2.4 荧光实时定量RT-PCR检测α-SMA、colⅠ、colⅢ表达
与正常组比较， TGF-β1影响组、pcDNA3转染组β-catenin途径α -SMA，colⅠ，colⅢmRNA表达增高（P<0.01），而两组比较无统计学差异，F-TrCP-Ecad转染组较TGF-β1影响组α-SMA、colⅠ、colⅢ表达下降（P<0.01），与正常组比较无统计学差异。见表3。
表3 各组细胞α-SMA 、colⅠ、col Ⅲ mRNA相对表达量比较
（x±s，n=8）
注：与正常组比较，aP<0.01；与F-TrCP-Ecad转染组比较，bP<0.01；与TGF-β1 影响组比较，cP<0.01；与pcDNA3转染组比较，dP<0.01
3 评论
肺成纤维细胞增殖与活性增强是肺纤维化发作的重要的致病进程，对其机制的研讨并寻觅新的医治靶点是现在研讨的焦点[7]。肺纤维化进程中在TGF-β1影响下[8]使肺成纤维细胞不断地增殖和转型为肌成纤维细胞（myofibroblast，MB）。MB是一种特别阶段的FB，可以很多排泄ECM，排泄才能是FB 的4～5倍，很多表达α-SMA、Fn、I、III型胶原，加快纤维化进程。
TGF-β1是诱导肺成纤维细胞活化发作的最重要的成长因子[9]，TGF-β1发挥效果的途径包含Smad、β-catenin和非Smad通路，其β-catenin途径与疾病及纤维化构成的病理进程高度相关[8]。Vuga，et al[10]发现WNT5A基因途径在IPF的肺成纤维细胞较正常肺成纤维细胞有显着地调理含义，经过非经典的WNT/β-catenin途径[11-13]WNT5A激活显着地诱导肺成纤维细胞增殖一起按捺细胞凋亡。Chilosi等[14]报导了在特发性肺纤维化（IPF）患者受损支气管基底细胞和损害部位肺成纤维细胞中可见β-catenin向细胞核内搬运、积累，提示β-catenin与肺纤维化及肺成纤维细胞活性的相关性，因而咱们想象经过按捺β-catenin功用可能对肺纤维化发挥医治效果。
F-TrCP-Ecad质粒是Cong[15]等规划的β-catenin靶向降解质粒，只降解细胞质中的β-catenin蛋白，而不损坏细胞膜上的β-catenin蛋白，然后削减其向细胞核内的搬运，下降其转录活性。本研讨选用该载体转染大鼠成纤维细胞，调查阻断β-catenin途径对肺成纤维细胞增殖及活性的影响。成果显现：TGF-β1影响48 h后，成纤维细胞体积显着增大，胞突消失，细胞数量显着增多，细胞空隙变小，F-TrCP-Ecad转染组大部分细胞呈梭型，有较长的突起，细胞间有显着空隙。CCK-8法检测F-TrCP-Ecad转染组肺成纤维细胞增殖较TGF-β1影响组显着下降。F-TrCP-Ecad转染组肺成纤维细胞间质细胞标志物α -SMA、Fn蛋白表达量显着低于TGF-β1影响组，E-cadherin表达量较TGF-β1影响组增高。F-TrCP-Ecad转染组大鼠肺成纤维细胞β-catenin途径转录产品α-SMA、colⅠ、colⅢ表达显着下降，证明β-catenin蛋白敲除经过降解细胞质中的β-catenin蛋白，削减其向细胞核内的搬运按捺TGF-β1 诱导的肺成纤维细胞增殖、活性增强，按捺纤维化进程。endprint
综上所述，TGF-β1是促进肺成纤维细胞增殖、活化的重要细胞因子，β-catenin途径是TGF-β1 发挥效果的重要信号通路，β-catenin蛋白敲除载体（F-TrCP-Ecad质粒）经过阻断该信号途径，阻断成纤维细胞转化为其活性方式肌成纤维细胞，一起按捺成纤维细胞开释胞外基质，阻断纤维化进程，然后能为肺纤维化疾病医治供给新的思路及试验根据。
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（收稿日期：2014-04-01）endprint
