宋朝彦+董晓辉+谢东
[摘要] 意图 评论结尾符号（TUNEL）法与caspase-3免疫安排化学法双标染色技能在研讨大鼠神经细胞凋亡机制中运用的优越性。 办法 雄性Wistar大鼠12只随机分红两组，用Marmarou办法构成大鼠重型弥漫性颅脑伤口。切片先依照试剂盒供给的办法行TUNEL染色显现凋亡，再按caspase-3免疫组化试剂盒检测办法持续染色。 成果 双标染色显色满足，大鼠海马区大部分TUNEL阳性细胞一起也体现caspase-3阳性。定论 caspase-3与TUNEL双标染色能更好的反映出大鼠脑伤口后caspase-3与凋亡之间的联系，体现了双标染色技能的优越性。
[要害词] 大鼠；免疫安排化学；双标染色；凋亡
[中图分类号] R651.15[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2014）19-0025-03
Double staining techniques in the study of caspase-3 and the apoptosis after traumatic brain injury in rats
SONG Chaoyan DONG Xiaohui XIE Dong
Department of Neurosurgery,Baoding City the First Hospital in Hebei Province，Baoding 071000，China
[Abstract] Objective To explore the advantage of double staining TUNEL in situ and immunohistochemical technique of casepase-3 expression following traumatic brain injury(TBI) in rats.Methods 12 male Wistar rats were randomly divided into 2 groups. According to Marmarou, severe closed brain injury was made. After that, TUNEL in situ was applied of the apoptosis cell in hippocampus region. Then immunohistochemical staining with Caspase-3 were performed of hippocampus region. Results Double staining was well showed that TUNEL positive cell appeared in hippocampus and Caspase-3 appeared in the same cell. Conclusion TUNEL and Caspase-3 double staining better reflect the relationship between caspase-3 and apoptosis following TBI in rats. Double staining showes the advantage in the relation of apoptosis and Caspase-3.
[Key words] Rats; Immunohistochemistry; Double staining; Apoptosis
双标染色技能现在在免疫安排化学现已遍及选用[1，2]，但双标染色技能要求相对较高，切片染色成功率低，特别对初学者因为细节方面的忽视，难以获得满足的染色成果。而关于双标染色技能的专门研讨文章较少，本试验运用大鼠颅脑伤口（TBI）模型，大鼠TBI后经过对海马安排进行caspase-3免疫组化与结尾符号（TUNEL）法染色，评论双标染色技能在研讨神经细胞凋亡机制中运用中的留意事项及优越性。
1资料与办法
1.1试验动物及分组
健康Wistar雄性大鼠（河北医科大学试验动物中心供给）12只，体重250～300 g。大鼠随机分红对照组、伤口组。其间伤口组8只（实践存活5只大鼠，因为模型逝世构成），对照组4只大鼠。
1.2大鼠伤口模型制备及选材
仿Marmarou办法[3]并依据实践情况加以改进树立模型，大鼠以腹腔打针戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉，头皮切开后选用450 g×1.5 m自由落体冲击大鼠顶骨制造大鼠脑损害模型。对照组仅予麻醉及头皮切开、缝合，但不致伤。于伤后3 d尽心灌注前固定，断头取脑，取大脑部分前囟后3.3~4.3 mm间行后固定。惯例脱水、白腊包埋，标本行接连冠状切片，厚度约7μm，置于经粘片剂处理过的载玻片上备用。
1.3 结尾符号（TUNEL）法与caspase-3免疫组化双标染色
TUNEL检测试剂盒购自美国Roche公司，变换液为碱性磷酸酶符号。所用caspase-3一抗购自美国Santa Cruz公司，SP免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技能有限公司。白腊切片经二甲苯脱蜡梯度酒精至水。首要严厉按TUNEL试剂盒所要求进程进行操作（空白对照[4]只加不含酶等量核苷酸反响液，余相同），用BCIP/NBT显色液显色（细胞核呈蓝紫色为显色阳性），避光室温下显色约20 min，显微镜下显色满足后，用0.01M PBS液冲刷2～3次停止显色。用蒸馏水冲刷去除切片剩余试剂。切片再次严厉按caspase-3免疫组化阐明书进程操作。空白对照用0.1M PBS液替代一抗其他进程相同。DAB显色剂显色约20 min，显微镜下显色满足后（细胞浆呈黄色为显色阳性），清水充沛冲刷，经酒精及二甲苯顺次处理后，中性树胶封片。
2成果
对照组未见显着染色。伤口组大部分TUNEL符号阳性细胞（细胞核呈蓝色）一起也体现caspase-3免疫染色阳性（细胞浆呈棕黄色），除此小部分TUNEL符号阳性细胞未见caspase-3免疫染色阳性，别的也有小部分caspase-3免疫染色阳性细胞未见TUNEL符号阳性。TUNEL空白对照仅显现caspase-3染色阳性，caspase-3空白对照仅显现TUNEL染色阳性（图1～3）。
图1 伤口组大鼠海马区神经细胞TUNEL与caspase-3双标染色400×（可见caspase-3染色与TUNEL染色）
图2 双标染色TUNEL空白对照400×（仅显现caspase-3染色阳性）
3评论
近年来，因为免疫安排化学的迅速发展，单克隆抗体的不断发生，因而人们对免疫组化技能的要求也越来越高，不仅仅满足于免疫组化的单一符号，并且需求两层或多重符号，其基本原理是依据符号物的不同，各自所符号的抗原呈现不同的色彩，在一张切片上或同一细胞内显现两种以上的抗原，光镜或荧光镜下依据不同的色彩来判别不同的抗原成分。运用这种技能能够了解到安排细胞间的构成和机能的联系，以及抗原成分相互之间的联系，为基础理论的评论，发病机制的研讨、疾病的确诊供给了重要的试验手法。
endprint
因为双标染色进程杂乱，所需时刻长，对切片的质量要求极高，因而在制造白腊切片时包埋、切片、展片、捞片、烤片进程中考究技巧以制造优秀的切片。这要求选材脱水必定要完全，白腊包埋时必定要到达浸蜡的均一，避免脱水不完全而构成的安排包埋不合格。切片时匀速，使切片首尾相连，以利于切片的下一步的搬运，在搬运到恒温水浴箱中不要呈现切片堆叠。水温应适宜，水温过高易构成切片过度涣散，水温过低展片时刻过长且不易平坦。水浴箱中避免气泡的发生，避免切片漂到气泡上，捞片进程中留意不要在切片和载玻片中心留有气泡，构成切片不平坦且易从载玻片上掉落影响后续操作及染色。烤片选用 60℃恒温箱烤片 1 h以上。时刻过短也会构成脱片。因为染色进程中需数次振动洗刷切片，防脱片非常重要，载玻片运用粘片剂等防脱片技能防备切片脱片。这些技能细节必定要注重，不然可能导致得不偿失。在咱们的试验中，因为在caspase-3免疫组化染色进程中需抗原热修正[5]，而TUNEL原位凋亡染色进程相对较少，对切片影响小，因而染色次序先行TUNEL原位凋亡染色后再行免疫组化染色，避免抗原热修正对DNA构成损害。
现在虽有全自动免疫组化仪的运用[6]，节约人力，标准自动化，但其自动化进程不灵敏，期间废片不能检出，构成试剂的糟蹋，增加了试验本钱，特别是第一次染色后，仍需人工断定切片是否能够持续进行第2次符号染色。因而在双标染色中不建议运用全自动免疫组化仪。染色进程中滴加一抗及二抗前用滤纸吸附剩余的水分，避免试剂稀释影响染色，一起所加抗体量要足，充沛掩盖切片，滴加抗体后孵育时刻要足够，一起应放在湿盒中避免枯燥，避免染色不均。
双标染色能够用单酶或两种酶体系进行染色。运用单酶做双标染色的首要不利因素为第一次符号抗体的残留部分不易洗去，易构成假阳性反响。尽管能够在两流程之间用酸洗和气化来加以克服，但总有必定差错。用两种酶别离符号两种不同的抗原，能够避免非特异性穿插反响，两种酶反响体系互不搅扰，显色明晰牢靠。因而现在研讨中多用两种酶符号不同的抗原进行显色。本试验为避免染色体系的搅扰运用过氧化物酶反响体系DAB显色剂显色显现caspase-3阳性细胞（呈黄色），用碱性磷酸酶反响体系NBT显色液显色显现凋亡细胞（呈蓝紫色），一起确保在第一次染色后色彩不能被后续进程洗脱。
现已证明大鼠颅脑伤口后海马区神经细胞可发生凋亡[7]。触发凋亡的途径许多[8]，但大多经过半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶级联反响，caspase-3被认为是caspases宗族中的要害蛋白酶[9]，TUNEL法经过符号凋亡细胞染色体DNA开裂后可发生许多的粘性3′-OH结尾特定的开裂端，因而是检测凋亡的重要办法[10]。在咱们的caspase-3和TENUL双标染色切片中，可见大部分caspase-3免疫染色阳性细胞TUNEL符号一起也体现阳性，阐明细胞凋亡大部分是经过caspase-3介导的[11]。一起在双标染色切片中也存在部分TUNEL阳性细胞阳性而未见caspase-3免疫染色阳性，这阐明有一部分细胞可能是经过其他途径凋亡的。一起一小部分caspase-3免疫染色阳性细胞未见TUNEL符号阳性，阐明caspase-3所介导的凋亡进程中因为凋亡按捺因子的存在，caspase-3失活，凋亡程序不能持续，部分细胞有存活下来的期望。双标染色技能能够在同一张切片中展现上述联系，很好的阐明晰这个问题。双标染色技能不光能够在此运用，也可用于相似的研讨中，是一项赋有生命力的技能。
[参考文献]
[1]Leriche M， Méndez M， Zimmer L， et al. Acute ethanol induces Fos in GABAergic and non-GAB Aergic forebrain neurons: a double-labeling study in the medial prefrontal cortex and extended amygdala[J]. Neuroscience，2008，153（1）:259-267.
[2]Wu X， Mao H， Liu J， et al. Dynamic change of SGK expression and its role in neuron apoptosis after traumatic brain injury[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2013，6（7）:1282-1293.
[3]Marmarou A， Foda MA， Vanden Brink W， et al.A new model of diffuse brain injury in rats[J]. Neurosurg，1994，80（2）:291-300.
[4]True LD. Quality control in molecular immunohistochemistry[J]. Histochem Cell Biol，2008， 130（3）:473-480.
[5]Fowler CB，Evers DL，O＇Leary TJ，et al. Antigen retrieval causes protein unfolding: evidence for a linear epitope model of recovered immunoreactivit[J]. J Histochem Cytochem，2011，59（4）:366-381．
[6]Le Neel T，Moreau A，Laboisse C，et al. Comparative evaluation of automated systems in immunohistochemistry[J].Clin Chim Acta，1998，278（2）:185-192．
[7]Lee IN， Lin MH， Chung CY， et al. Chronic cigarette smoke exposure enhances brain-derived neurotrophic factor expression in rats with traumatic brain injury[J]. Metab Brain Dis， 2012，27（2）:197-204.
[8]Zipfel GJ， Babcock DJ， Lee JM， et al.Neuronal apoptosis after CNS injury: the roles of glutamate and calcium[J]. J Neurotrauma， 2000，17（10）:857-869.
[9]Brot S， Rogemond V， Perrot V， et al. CRMP5 interacts with tubulin to inhibit neurite outgrowth，thereby modula ting the function of CRMP2[J]. J Neurosci，2010， 30（32）:10639-10654.
[10]Doonan F， Cotter TG. Detection of DNA fragmentation in retinal apoptosis by TUNEL[J]. Methods Mol Biol，2013， 935:207-213.
[11]Hu SQ， Zong YY， Fan LM， et al. Overexpression of PDZ1 domain prevents apoptosis of rat hippocampal neurons induced by kainic acid[J]. Neurosci Lett，2009， 460（2）:133-137.
（收稿日期：2014-03-10）
文题
文题应以最恰当、最简明的词语反映论文最重要的特定内容。一般运用能充沛反映论文主题内容的短语，不运用具有主、谓、宾结构的完好句子，一般不运用标点和缩略语。
中文文题一般不宜超越20个汉字。尽可能不设副题，确有必要时，可选用不同字体字号或加破折号将副题与正题加以区别。
endprint
因为双标染色进程杂乱，所需时刻长，对切片的质量要求极高，因而在制造白腊切片时包埋、切片、展片、捞片、烤片进程中考究技巧以制造优秀的切片。这要求选材脱水必定要完全，白腊包埋时必定要到达浸蜡的均一，避免脱水不完全而构成的安排包埋不合格。切片时匀速，使切片首尾相连，以利于切片的下一步的搬运，在搬运到恒温水浴箱中不要呈现切片堆叠。水温应适宜，水温过高易构成切片过度涣散，水温过低展片时刻过长且不易平坦。水浴箱中避免气泡的发生，避免切片漂到气泡上，捞片进程中留意不要在切片和载玻片中心留有气泡，构成切片不平坦且易从载玻片上掉落影响后续操作及染色。烤片选用 60℃恒温箱烤片 1 h以上。时刻过短也会构成脱片。因为染色进程中需数次振动洗刷切片，防脱片非常重要，载玻片运用粘片剂等防脱片技能防备切片脱片。这些技能细节必定要注重，不然可能导致得不偿失。在咱们的试验中，因为在caspase-3免疫组化染色进程中需抗原热修正[5]，而TUNEL原位凋亡染色进程相对较少，对切片影响小，因而染色次序先行TUNEL原位凋亡染色后再行免疫组化染色，避免抗原热修正对DNA构成损害。
现在虽有全自动免疫组化仪的运用[6]，节约人力，标准自动化，但其自动化进程不灵敏，期间废片不能检出，构成试剂的糟蹋，增加了试验本钱，特别是第一次染色后，仍需人工断定切片是否能够持续进行第2次符号染色。因而在双标染色中不建议运用全自动免疫组化仪。染色进程中滴加一抗及二抗前用滤纸吸附剩余的水分，避免试剂稀释影响染色，一起所加抗体量要足，充沛掩盖切片，滴加抗体后孵育时刻要足够，一起应放在湿盒中避免枯燥，避免染色不均。
双标染色能够用单酶或两种酶体系进行染色。运用单酶做双标染色的首要不利因素为第一次符号抗体的残留部分不易洗去，易构成假阳性反响。尽管能够在两流程之间用酸洗和气化来加以克服，但总有必定差错。用两种酶别离符号两种不同的抗原，能够避免非特异性穿插反响，两种酶反响体系互不搅扰，显色明晰牢靠。因而现在研讨中多用两种酶符号不同的抗原进行显色。本试验为避免染色体系的搅扰运用过氧化物酶反响体系DAB显色剂显色显现caspase-3阳性细胞（呈黄色），用碱性磷酸酶反响体系NBT显色液显色显现凋亡细胞（呈蓝紫色），一起确保在第一次染色后色彩不能被后续进程洗脱。
现已证明大鼠颅脑伤口后海马区神经细胞可发生凋亡[7]。触发凋亡的途径许多[8]，但大多经过半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶级联反响，caspase-3被认为是caspases宗族中的要害蛋白酶[9]，TUNEL法经过符号凋亡细胞染色体DNA开裂后可发生许多的粘性3′-OH结尾特定的开裂端，因而是检测凋亡的重要办法[10]。在咱们的caspase-3和TENUL双标染色切片中，可见大部分caspase-3免疫染色阳性细胞TUNEL符号一起也体现阳性，阐明细胞凋亡大部分是经过caspase-3介导的[11]。一起在双标染色切片中也存在部分TUNEL阳性细胞阳性而未见caspase-3免疫染色阳性，这阐明有一部分细胞可能是经过其他途径凋亡的。一起一小部分caspase-3免疫染色阳性细胞未见TUNEL符号阳性，阐明caspase-3所介导的凋亡进程中因为凋亡按捺因子的存在，caspase-3失活，凋亡程序不能持续，部分细胞有存活下来的期望。双标染色技能能够在同一张切片中展现上述联系，很好的阐明晰这个问题。双标染色技能不光能够在此运用，也可用于相似的研讨中，是一项赋有生命力的技能。
[参考文献]
[1]Leriche M， Méndez M， Zimmer L， et al. Acute ethanol induces Fos in GABAergic and non-GAB Aergic forebrain neurons: a double-labeling study in the medial prefrontal cortex and extended amygdala[J]. Neuroscience，2008，153（1）:259-267.
[2]Wu X， Mao H， Liu J， et al. Dynamic change of SGK expression and its role in neuron apoptosis after traumatic brain injury[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2013，6（7）:1282-1293.
[3]Marmarou A， Foda MA， Vanden Brink W， et al.A new model of diffuse brain injury in rats[J]. Neurosurg，1994，80（2）:291-300.
[4]True LD. Quality control in molecular immunohistochemistry[J]. Histochem Cell Biol，2008， 130（3）:473-480.
[5]Fowler CB，Evers DL，O＇Leary TJ，et al. Antigen retrieval causes protein unfolding: evidence for a linear epitope model of recovered immunoreactivit[J]. J Histochem Cytochem，2011，59（4）:366-381．
[6]Le Neel T，Moreau A，Laboisse C，et al. Comparative evaluation of automated systems in immunohistochemistry[J].Clin Chim Acta，1998，278（2）:185-192．
[7]Lee IN， Lin MH， Chung CY， et al. Chronic cigarette smoke exposure enhances brain-derived neurotrophic factor expression in rats with traumatic brain injury[J]. Metab Brain Dis， 2012，27（2）:197-204.
[8]Zipfel GJ， Babcock DJ， Lee JM， et al.Neuronal apoptosis after CNS injury: the roles of glutamate and calcium[J]. J Neurotrauma， 2000，17（10）:857-869.
[9]Brot S， Rogemond V， Perrot V， et al. CRMP5 interacts with tubulin to inhibit neurite outgrowth，thereby modula ting the function of CRMP2[J]. J Neurosci，2010， 30（32）:10639-10654.
[10]Doonan F， Cotter TG. Detection of DNA fragmentation in retinal apoptosis by TUNEL[J]. Methods Mol Biol，2013， 935:207-213.
[11]Hu SQ， Zong YY， Fan LM， et al. Overexpression of PDZ1 domain prevents apoptosis of rat hippocampal neurons induced by kainic acid[J]. Neurosci Lett，2009， 460（2）:133-137.
（收稿日期：2014-03-10）
文题
文题应以最恰当、最简明的词语反映论文最重要的特定内容。一般运用能充沛反映论文主题内容的短语，不运用具有主、谓、宾结构的完好句子，一般不运用标点和缩略语。
中文文题一般不宜超越20个汉字。尽可能不设副题，确有必要时，可选用不同字体字号或加破折号将副题与正题加以区别。
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因为双标染色进程杂乱，所需时刻长，对切片的质量要求极高，因而在制造白腊切片时包埋、切片、展片、捞片、烤片进程中考究技巧以制造优秀的切片。这要求选材脱水必定要完全，白腊包埋时必定要到达浸蜡的均一，避免脱水不完全而构成的安排包埋不合格。切片时匀速，使切片首尾相连，以利于切片的下一步的搬运，在搬运到恒温水浴箱中不要呈现切片堆叠。水温应适宜，水温过高易构成切片过度涣散，水温过低展片时刻过长且不易平坦。水浴箱中避免气泡的发生，避免切片漂到气泡上，捞片进程中留意不要在切片和载玻片中心留有气泡，构成切片不平坦且易从载玻片上掉落影响后续操作及染色。烤片选用 60℃恒温箱烤片 1 h以上。时刻过短也会构成脱片。因为染色进程中需数次振动洗刷切片，防脱片非常重要，载玻片运用粘片剂等防脱片技能防备切片脱片。这些技能细节必定要注重，不然可能导致得不偿失。在咱们的试验中，因为在caspase-3免疫组化染色进程中需抗原热修正[5]，而TUNEL原位凋亡染色进程相对较少，对切片影响小，因而染色次序先行TUNEL原位凋亡染色后再行免疫组化染色，避免抗原热修正对DNA构成损害。
现在虽有全自动免疫组化仪的运用[6]，节约人力，标准自动化，但其自动化进程不灵敏，期间废片不能检出，构成试剂的糟蹋，增加了试验本钱，特别是第一次染色后，仍需人工断定切片是否能够持续进行第2次符号染色。因而在双标染色中不建议运用全自动免疫组化仪。染色进程中滴加一抗及二抗前用滤纸吸附剩余的水分，避免试剂稀释影响染色，一起所加抗体量要足，充沛掩盖切片，滴加抗体后孵育时刻要足够，一起应放在湿盒中避免枯燥，避免染色不均。
双标染色能够用单酶或两种酶体系进行染色。运用单酶做双标染色的首要不利因素为第一次符号抗体的残留部分不易洗去，易构成假阳性反响。尽管能够在两流程之间用酸洗和气化来加以克服，但总有必定差错。用两种酶别离符号两种不同的抗原，能够避免非特异性穿插反响，两种酶反响体系互不搅扰，显色明晰牢靠。因而现在研讨中多用两种酶符号不同的抗原进行显色。本试验为避免染色体系的搅扰运用过氧化物酶反响体系DAB显色剂显色显现caspase-3阳性细胞（呈黄色），用碱性磷酸酶反响体系NBT显色液显色显现凋亡细胞（呈蓝紫色），一起确保在第一次染色后色彩不能被后续进程洗脱。
现已证明大鼠颅脑伤口后海马区神经细胞可发生凋亡[7]。触发凋亡的途径许多[8]，但大多经过半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶级联反响，caspase-3被认为是caspases宗族中的要害蛋白酶[9]，TUNEL法经过符号凋亡细胞染色体DNA开裂后可发生许多的粘性3′-OH结尾特定的开裂端，因而是检测凋亡的重要办法[10]。在咱们的caspase-3和TENUL双标染色切片中，可见大部分caspase-3免疫染色阳性细胞TUNEL符号一起也体现阳性，阐明细胞凋亡大部分是经过caspase-3介导的[11]。一起在双标染色切片中也存在部分TUNEL阳性细胞阳性而未见caspase-3免疫染色阳性，这阐明有一部分细胞可能是经过其他途径凋亡的。一起一小部分caspase-3免疫染色阳性细胞未见TUNEL符号阳性，阐明caspase-3所介导的凋亡进程中因为凋亡按捺因子的存在，caspase-3失活，凋亡程序不能持续，部分细胞有存活下来的期望。双标染色技能能够在同一张切片中展现上述联系，很好的阐明晰这个问题。双标染色技能不光能够在此运用，也可用于相似的研讨中，是一项赋有生命力的技能。
[参考文献]
[1]Leriche M， Méndez M， Zimmer L， et al. Acute ethanol induces Fos in GABAergic and non-GAB Aergic forebrain neurons: a double-labeling study in the medial prefrontal cortex and extended amygdala[J]. Neuroscience，2008，153（1）:259-267.
[2]Wu X， Mao H， Liu J， et al. Dynamic change of SGK expression and its role in neuron apoptosis after traumatic brain injury[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2013，6（7）:1282-1293.
[3]Marmarou A， Foda MA， Vanden Brink W， et al.A new model of diffuse brain injury in rats[J]. Neurosurg，1994，80（2）:291-300.
[4]True LD. Quality control in molecular immunohistochemistry[J]. Histochem Cell Biol，2008， 130（3）:473-480.
[5]Fowler CB，Evers DL，O＇Leary TJ，et al. Antigen retrieval causes protein unfolding: evidence for a linear epitope model of recovered immunoreactivit[J]. J Histochem Cytochem，2011，59（4）:366-381．
[6]Le Neel T，Moreau A，Laboisse C，et al. Comparative evaluation of automated systems in immunohistochemistry[J].Clin Chim Acta，1998，278（2）:185-192．
[7]Lee IN， Lin MH， Chung CY， et al. Chronic cigarette smoke exposure enhances brain-derived neurotrophic factor expression in rats with traumatic brain injury[J]. Metab Brain Dis， 2012，27（2）:197-204.
[8]Zipfel GJ， Babcock DJ， Lee JM， et al.Neuronal apoptosis after CNS injury: the roles of glutamate and calcium[J]. J Neurotrauma， 2000，17（10）:857-869.
[9]Brot S， Rogemond V， Perrot V， et al. CRMP5 interacts with tubulin to inhibit neurite outgrowth，thereby modula ting the function of CRMP2[J]. J Neurosci，2010， 30（32）:10639-10654.
[10]Doonan F， Cotter TG. Detection of DNA fragmentation in retinal apoptosis by TUNEL[J]. Methods Mol Biol，2013， 935:207-213.
[11]Hu SQ， Zong YY， Fan LM， et al. Overexpression of PDZ1 domain prevents apoptosis of rat hippocampal neurons induced by kainic acid[J]. Neurosci Lett，2009， 460（2）:133-137.
（收稿日期：2014-03-10）
文题
文题应以最恰当、最简明的词语反映论文最重要的特定内容。一般运用能充沛反映论文主题内容的短语，不运用具有主、谓、宾结构的完好句子，一般不运用标点和缩略语。
中文文题一般不宜超越20个汉字。尽可能不设副题，确有必要时，可选用不同字体字号或加破折号将副题与正题加以区别。
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