孙伟+王小平+金文扬
[摘要] 意图 研讨内毒素血症Wistar大鼠血清TNF-α与心肌细胞凋亡的联系及EPO对其的影响。 办法 将180只Wistar大鼠随机分为对照组、脂多糖LPS组及EPO处理组，分别在处理后2h、 4h、 6h、 12h、 24h断头取血并取其心脏。选用ELISA法测定血清TNF-α，用TUNEL法检测原位凋亡。 成果 ①LPS组TNF-α浓度在2h时到达最大值，且显着高于对照组（P<0.05），随后TNF-α浓度开端下降，并在6h时降到正常，与对照组之间无统计学差异（P>0.05）。LPS+EPO组TNF-α浓度在2 h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），随后开端下降，在6h时降到正常值；②LPS组心肌细胞凋亡指数在2h时到达最大值，且显着高于对照组（P<0.05），随后开端下降，并在4h、6h、12h、24h时均显着高于对照组（P<0.05）。LPS+EPO组心肌细胞凋亡指数在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），随后开端下降，并在4 h、6 h、12 h、24 h时均显着低于LPS组（P<0.05）；③心肌细胞凋亡指数与血清TNF-α存在显着的直线正相关性。定论 血清TNF-α参加了内毒素血症Wistar大鼠的心肌损害的病理进程，与心肌细胞凋亡呈正相关性，EPO经过按捺TNF-α的发作而推迟心肌细胞凋亡，对内毒素血症Wistar大鼠的心肌具有维护效果。
[关键词] 内毒素血症；TNF-α；心肌细胞凋亡指数；EPO
[中图分类号] R541 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）02-0001-03
A study on the relationship between endotoxemia serum TNF-α of Wistar rats and apoptosis of myocardial cell
SUN Wei WANG Xiaoping JIN Wenyang
Emergency Department， Taizhou Hospital， Enze Medical Center of Taizhou in Zhejiang province，Taizhou 317000，China
[Abstract] Objective To study the relationship of rat serum TNF-α of endotoxin blood disease and the apoptosis of myocardial cells and EPOs effects on it. Methods 180 Wistar rats were randomly divided into the control group， lipopolysaccharide LPS group and EPO treatment group. All the rats were respectively beheaded 2h， 4h， 6h， 12h and 24h after treatment for their blood samples and their levers were also taken out. Their TNF-α were tested by way of ELISA， and their in situ apoptosis were tested through the method of TUNEL. Results ①The TNF-α concentration of the LPS group reached its highest level in 2 hours， and it was obviously higher than that of the control group（P<0.05）， then the concentration began to decrease， and resumed its normal level in 6 hours. It was statistically insignificant（P>0.05）. The TNF-α concentration of LPS+EPO group reached its peak in 2 hours， and it was obviously lower than that of the LPS group （P<0.05）， then it began to decrease， and became normal in 6 hours； ②The apoptosis index of myocardial cells of the LPS group reached its peak in 2 hours， and it was obviously higher than that of the control group （P<0.05）， then it began to decrease， it was respectively and obviously higher than that of the control group in 4h， 6h， 12h and 24h （P<0.05）. The apoptosis index of myocardial cells of the LPS+EPO group reached its peak in 2 hours， and it was obviously lower than that of the control group （P<0.05）， then it began to decrease， and was respectively and obviously lower than that of the LPS group in 4h， 6h， 12h and 24h （P<0.05）； ③ The myocardial apoptosis index had an obviously positive linear correlation with TNF-α. Conclusion The serum TNF-α is involved in the myocardial pathological injury process of Wistar rats with endotoxin blood disease， it has a positive correlation with myocardial cell apoptosis. EPO can prolong the process of myocardial cell apoptosis by inhibiting the production of TNF-α， it is myocardially protective for Wistar rats with endotoxin blood disease.
[Key words] Dndotoxin blood disease； TNF-α； Apoptosis index of myocardial cells； EPO
近年来研讨证明，机体在遭受感染时首要发作的、起核心效果的炎症介质是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF），尤其是TNF-α。脂多糖（LPS）是引起感染性休克机体损害的首要物质，可对机体构成广泛的影响及损害，并引起心率减慢、心肌缩短力下降，严重影响心功用[1]。已有研讨标明[2]，EPO对心脏有维护效果。现在TNF-α与内毒素血症心肌细胞凋亡之间联系未见体系报导，外源性EPO对心肌的维护机制尚不清楚。本研讨于2011年9月到2012年12月经过动物试验，选用ELISA法测定血清TNF-α，用TUNEL法检测原位凋亡，评论血清TNF-α与心肌细胞凋亡的联系及EPO对其的影响，为促红细胞生成素在脓毒症患者中的使用供给理论根据。
1 材料与办法
1.1 试验动物及试剂
180只健康Wistar大鼠，不分男女，体重为（20±2）g，购买于华中科技大学同济医学院试验动物中心，许可证号为：SCXK（鄂）2004-0007。
EPO（产品序号CSB-E04539m）以及ELISA试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司，脂多糖LPS购于SIGMA公司，产品序号L2880。用于TUNEL法检测原位凋亡的In situ cell death detection试剂盒购于德国Boehringer-Mannheim公司。
1.2 试验办法
将180只Wistar大鼠随机分为对照组、脂多糖LPS组及EPO处理组，每组60只，每小组分红2h、 4h、 6h、 12h、 24h五个亚组，每个亚组12只。脂多糖LPS组给予腹腔打针LPS 0.5mg/kg，对照组大鼠给予腹腔打针等量生理盐水，EPO组大鼠给予腹腔打针LPS 0.5mg/kg及EPO 4000U/kg。各亚组大鼠在所对应的时刻点断头取血0.5mL，离心保存在-20℃冰箱等候检测。并立刻解剖取其心脏保存在-20℃冰箱。选用ELISA法测定血清TNF-α，用TUNEL法检测原位凋亡。
1.3 研讨目标及测定办法
血清TNF-α浓度的测定：选用双抗体夹心ELISA法。TNF-α的浓度单位以pg/mL标明，试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司。严厉依照试剂盒的说明书进行试验操作，显色今后从全自动酶标仪上直接读数得到TNF-α浓度值。
心肌细胞凋亡的测定：选用大鼠的左心室心肌行白腊切片，严厉按试剂盒说明书进行操作。每只大鼠调查10张切片，每张切片在光镜下（×400）随机选10个视界，图画剖析用MICRO-COS-MOS MiVnt图片剖析体系，得到阳性细胞百分率及阳性细胞胞浆胞核的均匀光密度值（MOD），算出细胞凋亡指数AI（AI%=MOD×阳性细胞百分率×100）。
1.4 统计学剖析
选用SPSS13.0软件进行统计学剖析，TNF-α浓度及心肌细胞凋亡指数均为定量材料，选用均数±标准差（x±s）标明，运用方差剖析；相关剖析选用简略相关剖析法。P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 内毒素血症Wistar大鼠血清TNF-α改动
LPS组TNF-α的浓度在2h时到达最大值，且显着高于生理盐水对照组（P<0.05），随后TNF-α浓度开端下降，并在6h时降到正常，与生理盐水对照组之间无统计学差异（P>0.05）。LPS+EPO组TNF-α浓度在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），随后开端下降，在6h时降到正常值。内毒素血症Wistar大鼠血清TNF-α改动详细情况见表1。
2.2 内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数改动
LPS组心肌细胞凋亡指数在2h时到达最大值，且显着高于生理盐水对照组（P<0.05），随后心肌细胞凋亡指数开端下降，并在4h，6h，12h，24h时均显着高于生理盐水对照组（P<0.05）。LPS+EPO组心肌细胞凋亡指数在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），随后开端下降，并在4h、6h、12h、24h时均显着低于LPS组（P<0.05）。内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数改动详细情况见表2。
2.3 内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数与血清TNF-α之间的相关性
经过简略相关剖析标明，内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数与血清TNF-α存在显着的直线正相关性（r=0.7643，P<0.05，Y=457.58X-109.63）。
3 评论
脓毒血症是临床上较多见的危重病，一般引起多器官功用的衰竭而导致患者逝世。脓毒血症是学界公认的导致重症患者逝世的首要要素，特别是脓毒症休克（sepsis shock）患者的逝世率到达46.5%。脓毒血症的发作常常是因为细菌排泄的内毒素开释进入血液。内毒素可使机体发作全身炎症反响综合症进而损害多器官脏器，尤其是导致血液循环紊乱及心功用衰竭。脓毒症的发病机理非常复杂，触及炎症、感染、安排损害及免疫等诸多方面，并联系到多器官病理生理的改动。本试验成果标明，内毒素诱导的内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数显着高于生理盐水对照组（P<0.05），标明脓毒症可诱导心肌细胞凋亡。内毒素诱导的脓毒症导致心肌细胞凋亡的详细机理尽管还不非常清楚，但心肌细胞凋亡后心肌缩短力下降，会加快内毒素对心肌的损害进程[3，4]。
机体遭到LPS影响后，巨噬细胞会显着上调TNFmRNA的表达，进而组成排泄TNF-α添加，可诱导细胞凋亡进而损害心脏功用，与心力衰竭的发作开展有密切联系。TNF-α是活化T淋巴细胞及巨噬细胞排泄的免疫调节因子，其生物学活性非常广泛。正常人血清中的TNF-α浓度较低，感染性休克或脓毒症患者血清TNF-α浓度显着添加[5，6]。本试验成果显现，LPS组TNF-α浓度在2h时到达最大值，且显着高于对照组（P<0.05），标明血清TNF-α参加了内毒素血症Wistar大鼠的心肌损害的病理进程，与心肌细胞凋亡呈正相关性。
EPO是人工克隆的生长因子，一般用于医治贫血以促进红细胞的生成，在临床上得到广泛使用已久。EPO造血活性的首要机理不是直接影响红细胞的发作，而是按捺晚红系祖细胞的凋亡[7]。可见EPO有推迟细胞凋亡的功用，其按捺细胞凋亡的详细机制现在尚不清晰。有研讨发现肝脏、脑、子宫等器官及肿瘤安排中有EPO受体的存在，EPO的其他临床功用逐步得到注重[8]。近些年来对EPO的脑维护效果研讨较多，EPO及其受体经过抗炎、抗凋亡、抗氧化等效果，可减轻神经安排缺血再灌注损害。有报导指出EPO可显着推迟缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡，此外在器官水平的试验标明EPO可削减缺血再灌注心肌梗死及损害心肌的规模，进而进步心功用[9，10]。本研讨成果显现，LPS+EPO组TNF-α浓度在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），随后开端下降，在6h时降到正常值，LPS+EPO组心肌细胞凋亡指数在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），标明EPO经过按捺TNF-α的发作而推迟心肌细胞凋亡，对内毒素血症Wistar大鼠的心肌具有维护效果。
本组研讨成果显现，内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数与血清TNF-α存在显着的直线正相关性（r=0.7643，P<0.05，Y=457.58X-109.63），标明TNF-α是参加内毒素血症大鼠心肌细胞凋亡的一个重要要素。进一步研讨成果显现，LPS+EPO组TNF-α浓度在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），随后开端下降，在6h时降到正常值，标明外源性EPO可按捺TNF-α的发作。给予脓毒血症大鼠外源性EPO可下降血清TNF-α的水平，然后下降心肌细胞凋亡指数，推迟心肌细胞凋亡，改进大鼠心肌缩短力及心功用，下降大鼠病死率。
总归，血清TNF-α参加了内毒素血症Wistar大鼠的心肌损害的病理进程，与心肌细胞凋亡呈正相关性，EPO经过按捺TNF-α的发作而推迟心肌细胞凋亡，对内毒素血症Wistar大鼠的心肌具有维护效果。本研讨成果为EPO医治脓毒症患者心肌损害供给了试验根据。
[参考文献]
[1] 尹海燕，何志捷，王吉文，等. 谷氨酰胺对脓毒症大鼠心肌细胞Bcl-2/Bax表达的影响[J]. 中华急诊医学杂志，2009， 18（10）：1037-1042.
[2] Lohner R， Schwederski M， Narath C，et al. Toll-Like Receptor 9 Promotes Cardiac Inflammation and Heart Failure during Polymicrobial Sepsis[J]. Mediators Inflamm，2013，7（12）：363-366.
[3] 徐良，周凯. EPO对失血性休克兼并内毒素血症兔TNF-α、IL-6、IL-10、MDA影响的研讨[J]. 浙江中医药大学学报，2010，34（2）：155-157.
[4] 曲海，吴玉娟，朱明. 沙利度胺对内毒素影响大鼠腹腔巨噬细胞排泄TNF-α和IL-6的影响[J]. 我国现代医师，2008，46（10）：16-18.
[5] 唐焕金，谢长青. 莫西沙星按捺内毒素诱导THP-1发作TNF-α和IL-8的分子机制[J]. 我国现代医师，2009，47（8）：47-48.
[6] 王昆鹏，刘贵明，丁学琴. 内毒素预处理对内毒素血症鼠的效果及机制[J]. 广东医学，2012，33（14）：2038-2041.
[7] 卢明芹，许绚丽，陈永平，等. 内毒素耐受对D-GalN/LPS致大鼠肝损害维护[J]. 我国公共卫生，2008，24（12）：1493-1494.
[8] Garcia-Barrios A， Gascon S. The effect of cytokines on intestinal sugar absorption during sepsis in rabbits[J]. Res Vet Sci，2013，95（2）：480-482.
[9] 周红梅， 尤文军， 张晓进. 热休克蛋白27改进小鼠内毒素血症心功用不全的机制[J]. 中华急诊医学杂志，2010， 19（5）：482-487.
[10] 闫士莲，许国星，钟传茂，等. 肿瘤坏死因子-α与糖尿病心肌病联系的试验研讨[J]. 我国现代医师，2007，45（12）：20-23.
（收稿日期：2013-08-14）
EPO是人工克隆的生长因子，一般用于医治贫血以促进红细胞的生成，在临床上得到广泛使用已久。EPO造血活性的首要机理不是直接影响红细胞的发作，而是按捺晚红系祖细胞的凋亡[7]。可见EPO有推迟细胞凋亡的功用，其按捺细胞凋亡的详细机制现在尚不清晰。有研讨发现肝脏、脑、子宫等器官及肿瘤安排中有EPO受体的存在，EPO的其他临床功用逐步得到注重[8]。近些年来对EPO的脑维护效果研讨较多，EPO及其受体经过抗炎、抗凋亡、抗氧化等效果，可减轻神经安排缺血再灌注损害。有报导指出EPO可显着推迟缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡，此外在器官水平的试验标明EPO可削减缺血再灌注心肌梗死及损害心肌的规模，进而进步心功用[9，10]。本研讨成果显现，LPS+EPO组TNF-α浓度在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），随后开端下降，在6h时降到正常值，LPS+EPO组心肌细胞凋亡指数在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），标明EPO经过按捺TNF-α的发作而推迟心肌细胞凋亡，对内毒素血症Wistar大鼠的心肌具有维护效果。
本组研讨成果显现，内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数与血清TNF-α存在显着的直线正相关性（r=0.7643，P<0.05，Y=457.58X-109.63），标明TNF-α是参加内毒素血症大鼠心肌细胞凋亡的一个重要要素。进一步研讨成果显现，LPS+EPO组TNF-α浓度在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），随后开端下降，在6h时降到正常值，标明外源性EPO可按捺TNF-α的发作。给予脓毒血症大鼠外源性EPO可下降血清TNF-α的水平，然后下降心肌细胞凋亡指数，推迟心肌细胞凋亡，改进大鼠心肌缩短力及心功用，下降大鼠病死率。
总归，血清TNF-α参加了内毒素血症Wistar大鼠的心肌损害的病理进程，与心肌细胞凋亡呈正相关性，EPO经过按捺TNF-α的发作而推迟心肌细胞凋亡，对内毒素血症Wistar大鼠的心肌具有维护效果。本研讨成果为EPO医治脓毒症患者心肌损害供给了试验根据。
[参考文献]
[1] 尹海燕，何志捷，王吉文，等. 谷氨酰胺对脓毒症大鼠心肌细胞Bcl-2/Bax表达的影响[J]. 中华急诊医学杂志，2009， 18（10）：1037-1042.
[2] Lohner R， Schwederski M， Narath C，et al. Toll-Like Receptor 9 Promotes Cardiac Inflammation and Heart Failure during Polymicrobial Sepsis[J]. Mediators Inflamm，2013，7（12）：363-366.
[3] 徐良，周凯. EPO对失血性休克兼并内毒素血症兔TNF-α、IL-6、IL-10、MDA影响的研讨[J]. 浙江中医药大学学报，2010，34（2）：155-157.
[4] 曲海，吴玉娟，朱明. 沙利度胺对内毒素影响大鼠腹腔巨噬细胞排泄TNF-α和IL-6的影响[J]. 我国现代医师，2008，46（10）：16-18.
[5] 唐焕金，谢长青. 莫西沙星按捺内毒素诱导THP-1发作TNF-α和IL-8的分子机制[J]. 我国现代医师，2009，47（8）：47-48.
[6] 王昆鹏，刘贵明，丁学琴. 内毒素预处理对内毒素血症鼠的效果及机制[J]. 广东医学，2012，33（14）：2038-2041.
[7] 卢明芹，许绚丽，陈永平，等. 内毒素耐受对D-GalN/LPS致大鼠肝损害维护[J]. 我国公共卫生，2008，24（12）：1493-1494.
[8] Garcia-Barrios A， Gascon S. The effect of cytokines on intestinal sugar absorption during sepsis in rabbits[J]. Res Vet Sci，2013，95（2）：480-482.
[9] 周红梅， 尤文军， 张晓进. 热休克蛋白27改进小鼠内毒素血症心功用不全的机制[J]. 中华急诊医学杂志，2010， 19（5）：482-487.
[10] 闫士莲，许国星，钟传茂，等. 肿瘤坏死因子-α与糖尿病心肌病联系的试验研讨[J]. 我国现代医师，2007，45（12）：20-23.
（收稿日期：2013-08-14）
EPO是人工克隆的生长因子，一般用于医治贫血以促进红细胞的生成，在临床上得到广泛使用已久。EPO造血活性的首要机理不是直接影响红细胞的发作，而是按捺晚红系祖细胞的凋亡[7]。可见EPO有推迟细胞凋亡的功用，其按捺细胞凋亡的详细机制现在尚不清晰。有研讨发现肝脏、脑、子宫等器官及肿瘤安排中有EPO受体的存在，EPO的其他临床功用逐步得到注重[8]。近些年来对EPO的脑维护效果研讨较多，EPO及其受体经过抗炎、抗凋亡、抗氧化等效果，可减轻神经安排缺血再灌注损害。有报导指出EPO可显着推迟缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡，此外在器官水平的试验标明EPO可削减缺血再灌注心肌梗死及损害心肌的规模，进而进步心功用[9，10]。本研讨成果显现，LPS+EPO组TNF-α浓度在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），随后开端下降，在6h时降到正常值，LPS+EPO组心肌细胞凋亡指数在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），标明EPO经过按捺TNF-α的发作而推迟心肌细胞凋亡，对内毒素血症Wistar大鼠的心肌具有维护效果。
本组研讨成果显现，内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数与血清TNF-α存在显着的直线正相关性（r=0.7643，P<0.05，Y=457.58X-109.63），标明TNF-α是参加内毒素血症大鼠心肌细胞凋亡的一个重要要素。进一步研讨成果显现，LPS+EPO组TNF-α浓度在2h时到达最大值，且显着低于LPS组（P<0.05），随后开端下降，在6h时降到正常值，标明外源性EPO可按捺TNF-α的发作。给予脓毒血症大鼠外源性EPO可下降血清TNF-α的水平，然后下降心肌细胞凋亡指数，推迟心肌细胞凋亡，改进大鼠心肌缩短力及心功用，下降大鼠病死率。
总归，血清TNF-α参加了内毒素血症Wistar大鼠的心肌损害的病理进程，与心肌细胞凋亡呈正相关性，EPO经过按捺TNF-α的发作而推迟心肌细胞凋亡，对内毒素血症Wistar大鼠的心肌具有维护效果。本研讨成果为EPO医治脓毒症患者心肌损害供给了试验根据。
[参考文献]
[1] 尹海燕，何志捷，王吉文，等. 谷氨酰胺对脓毒症大鼠心肌细胞Bcl-2/Bax表达的影响[J]. 中华急诊医学杂志，2009， 18（10）：1037-1042.
[2] Lohner R， Schwederski M， Narath C，et al. Toll-Like Receptor 9 Promotes Cardiac Inflammation and Heart Failure during Polymicrobial Sepsis[J]. Mediators Inflamm，2013，7（12）：363-366.
[3] 徐良，周凯. EPO对失血性休克兼并内毒素血症兔TNF-α、IL-6、IL-10、MDA影响的研讨[J]. 浙江中医药大学学报，2010，34（2）：155-157.
[4] 曲海，吴玉娟，朱明. 沙利度胺对内毒素影响大鼠腹腔巨噬细胞排泄TNF-α和IL-6的影响[J]. 我国现代医师，2008，46（10）：16-18.
[5] 唐焕金，谢长青. 莫西沙星按捺内毒素诱导THP-1发作TNF-α和IL-8的分子机制[J]. 我国现代医师，2009，47（8）：47-48.
[6] 王昆鹏，刘贵明，丁学琴. 内毒素预处理对内毒素血症鼠的效果及机制[J]. 广东医学，2012，33（14）：2038-2041.
[7] 卢明芹，许绚丽，陈永平，等. 内毒素耐受对D-GalN/LPS致大鼠肝损害维护[J]. 我国公共卫生，2008，24（12）：1493-1494.
[8] Garcia-Barrios A， Gascon S. The effect of cytokines on intestinal sugar absorption during sepsis in rabbits[J]. Res Vet Sci，2013，95（2）：480-482.
[9] 周红梅， 尤文军， 张晓进. 热休克蛋白27改进小鼠内毒素血症心功用不全的机制[J]. 中华急诊医学杂志，2010， 19（5）：482-487.
[10] 闫士莲，许国星，钟传茂，等. 肿瘤坏死因子-α与糖尿病心肌病联系的试验研讨[J]. 我国现代医师，2007，45（12）：20-23.
（收稿日期：2013-08-14）
