林崇强 刘涛 唐中力 刘阳春 李浪
[摘要]意图 探討猪冠状动脉微栓塞（CME）后心肌细胞凋亡与内质网应激相关蛋白C/EBP同源性蛋白（CHOP）表达的联系。办法 将选取的50头小型猪随机分为Sham组和CME组，每组25头。选用介入法经冠脉内注入微栓塞球树立CME模型，Sham组经冠脉内注入等量生理盐水。依据术后调查时刻点进一步分为3 h组、6 h组、12 h组、24 h组、48 h组，每组5头。运用超声心动图检测心功用，HE染色调查心肌安排病理学改动，苏木素碱性复红苦味酸（HBFP）染色检测心肌微梗死面积，缺口结尾标记（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡，Western blot检测心肌安排CHOP、Caspase-3蛋白表达。成果 与相应Sham组比较，CME后各时刻点心功用均不同程度下降（P<0.05），CME后12 h心功用下降最显着。CME后各时刻点均可见多发局灶性微梗死心肌，以心内膜下及左心室为多，无大片坏死，各组间微梗死面积比较，差异无计算学含义（P>0.05）。与相应Sham组比较，CME组各时刻点心肌细胞凋亡指数不同程度添加（P<0.05），CME后12 h心肌细胞凋亡达顶峰。凋亡心肌细胞首要坐落微梗死区及其边际区。与相应Sham组比较，CME组各时刻点CHOP、Caspase-3蛋白表达不同程度上调（P<0.05），呈动态改动，CME后12 h达顶峰。定论 CME后CHOP蛋白表达上调可能参加内质网应激诱导的心肌细胞凋亡。
[要害词]冠状动脉微栓塞；凋亡；C/EBP同源蛋白；内质网应激
[中图分类号] R543.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）4（c）-0009-05
The relationship of myocardial apoptosis and endoplasmic reticulum stress-related protein CHOP in swine following coronary microembolization
LIN Chong-qiang1 LIU Tao2 TANG Zhong-li3 LIU Yang-chun4 LI Lang4
1.Department of Cardiovasolar Medicine，People′s Hospital of Cenxi City in Guangxi Zhuang Autonomous Region，Cenxi 543200，China；2.Department of Cardiovasolar Medicine，Minzu Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530001，China；3.Department of Cardiovasolar Medicine，People′s Hospital of Dao County in Hunan Province，Dao County 425300，China；4.Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530001，China
[Abstract]Objective To investigate the relation of myocardial apoptosis and endoplasmic reticulum stress-related （CME） protein C/EBP homologous protein （CHOP） in swine following coronary microembolization.Methods Fifty swine were selected and randomly divided into the Sham group （n=25） and the CME group （n=25）.Five subgroups were assigned according to time points （3，6，12，24，48 h），5 cases in each group.The CME model was established through injecting microspheres into the coronary artery，while swine in the Sham group received the same dose of normal saline instead.Cardiac function was measured with echocardiography.Histopathological changes were detected with HE.Microinfarction and apoptotic index were detected with hematoxylinbasic fuchsinpicric acid （HBFP） and TUNEL stainings，respectively.The expressions of CHOP and Caspase-3 proteins were determined with Western blot.Results Compared with the Sham groups，the cardiac function was decreased in varying degrees in the corresponding CME groups （P<0.05）.The cardiac function of 12 h following CME was the worst.Microinfarction rather than massive necrosis was found each time points following CME，mainly located in left ventricle and subendocardial myocardium.The difference，however，was not statistically significant （P>0.05）.Compared with the Sham groups，the apoptotic index in the corresponding CME groups were increased in varying degrees （P<0.05）.It peaked 12 h following CME.Apoptotic cardiomyocytes were mainly located in microinfarct area and its border area.Compared with the Sham groups，CHOP protein expression in the corresponding groups following CME enhanced in varying degrees （P<0.05），showing dynamic changes.It peaked 12 h following CME.Conclusion CME induces cardiomyocyte apoptosis and cardiac dysfunction，in which enhanced CHOP and caspase-3 expression may be involved.
[Key words]Coronary microembolization；Apoptosis；CHOP；Endoplasmic reticulum stress
经皮冠状动脉介入医治（PCI）是现在医治急性ST段举高型心肌梗死的首选办法[1-2]。但是，即便免除心外膜冠状动脉阻塞或狭隘，仍有部分患者未能到达心肌水平灌注，称之为无复流现象。无复流现象是患者远期预后不良的独立猜测因子，较之PCI术后再灌注杰出者，发作无复流的患者前期梗身后并发症（恶性心律失常、心包积液、心包填塞、充血性心力衰竭）、左心室重构、晚期因心衰再次住院率及短期和长时刻逝世率显着升高[3]。研讨显现，冠状动脉微栓塞（CME）是导致PCI术中发作无复流现象的首要原因之一[4]。PCI术中机械性操作致粥样斑块碎片和（或）血栓性碎屑随前向血流流入远端微循环，引起冠状动脉微循环阻塞，然后导致心肌微梗死、冠脉血流储藏下降及心脏缩短功用障碍，而现在临床上对防备CME发作并无非常有用的办法[5]。现在的研讨显现，心肌细胞凋亡是CME致心肌损害的重要机制之一[6-7]。除线粒体途径和逝世受体途径外，内质网途径亦被证明参加细胞凋亡调控[8]。CME可导致钙稳态失衡及氧化应激反响，进而发作内质网应激。当应激继续存在或较激烈，损害了内质网功用，且这些反响不足以康复内质网稳态时，则可激活内质网凋亡通路。C/EBP同源蛋白（CHOP）为内质网应激介导的细胞凋亡的经典标志物之一[9]。关于CHOP在CME后心肌安排表达的动态改动，现在国内外鲜有研讨报导。本试验拟经冠脉内打针微栓塞球树立猪CME模型，调查CME后不一起刻点心肌细胞凋亡及内质网应激相关蛋白CHOP的表达改动，以评论两者之间的联系。
1目标与办法
1.1首要仪器与试剂
42 μm微栓塞球（Dynospheres；Dyno Particles；Lillestrom，Norway）；6F JL4.0指引导管（CordisInc.USA）；0.014英寸Runthrough指引导丝（Terumo Medical Corporation，Japan）；1.8F微导管（CordisInc.USA）；4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司，我国）；兔抗猪CHOP、caspase-3抗体（abcam，USA）；兔抗猪GAPDH抗体（Cell Signaling Technology，USA），羊抗兔荧光二抗（LICOR，USA），TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒（Roche，USA）。
1.2 CME模型树立及试验分组
选取健康巴马系小型猪50头，男女不限，体质量25～30 kg，由广西大学动物科学技术学院供给（许可证号：SCXK桂2007-0003）。将其随机分为Sham组及CME组，每组25头。以氯胺酮（山西太原药业有限公司，国药准字 H14022824，20 mg/kg）和阿托品（河南天方药业股份有限公司，国药准字H41020290， 2 mg/头）诱导麻醉成功后，以地西泮（山西太原药业有限公司，国药准字 H14021957）静脉打针保持冷静。对右侧腹股沟区行惯例消毒铺巾，2%利多卡因（山东圣鲁制药有限公司，国药准字 H20063986）部分麻醉。别离并穿刺右侧股动脉，成功后置入6F桡动脉鞘管，鞘内注入肝素（北京双鹤药业有限公司，国药准字 H110 20963）200 U/kg达肝素化，继以100 U/kg/h保持。经鞘管送入6F JL指引导管并行冠脉造影断定前降支，然后在指引导丝支撑下送入1.8F微导管至前降支中段，经微导管于40 min内注入10万个微栓塞球（悬浮于生理盐水中，浓度为1×104个/ml）10 ml，Sham组经冠脉内注入等量生理盐水，术毕肌内打针青霉素（桂林南药股份有限公司，国药准字 H45021515）80万单位防备感染。每组试验动物按调查时刻点不同进一步分为3 h组、6 h组、12 h组、24 h组及48 h组，每组5头。
1.3调查指標及检测办法
1.3.1心功用检测 各组动物别离于术后相应时刻点行心功用查看。右侧卧位固定，运用GE VIVID 7型超声心动图仪，探头频率1.5～4.3 MHz，别离沿胸骨旁左室长轴及短轴切面检测左室射血分数（LVEF）、左室舒张期末径（LVEDD）、短轴缩短率（FS）及心排血量（CO）。一切图画收集均由一名超声科专科医生完结。
1.3.2心肌安排选材 检测心功用后，经耳缘静脉注入10 ml 10%氯化钾（桂林南药股份有限公司，国药准字 H45020099），使心脏停博于心室舒张期，敏捷取出心脏，生理盐水冲刷洁净。选材部位为前降支中段以远所分配的心肌安排。部分心肌安排当即转移至-80℃冰箱保存，用于Western blot检测，其他用4%多聚甲醛固定后用于安排病理学检测。
1.3.3苏木素碱性复红苦味酸（HBFP）染色检测心肌微梗死面积 HBFP是一种检测前期心肌缺血及梗死的重要办法。正常心肌安排染成黄色，缺血心肌呈赤色。每组选取5张切片行HBFP染色，每张片随机选取5个视界（×100），运用DMR+Q550病理图画剖析仪（Leica，Germany）调查，选用Leica Qwin剖析软件（Leica，Germany）以平面法丈量赤色梗死区域，梗死面积表明为总剖析切片面积的百分比，取平均值。
1.3.4缺口结尾标记（TUNEL）染色检测心肌细胞凋亡 严厉依照TUNEL检测试剂盒阐明操作。切片惯例脱蜡，胰蛋白酶K37℃孵育30 min，参加TUNEL反响液，37℃孵育60 min，参加转化剂（POD）37℃孵育30 min及DAB底物溶液室温孵育3 min，封片后于400倍光学显微镜下随机选取10～15个不堆叠视界调查。TUNEL阳性信号定坐落细胞核，正常细胞呈淡蓝色，凋亡细胞呈棕黄色，一起结合形态学特征（细胞体积缩小、核染色质细密及核碎裂）判别凋亡心肌细胞，核算心肌细胞凋亡指数（凋亡指数=凋亡细胞/总细胞数×100%）。
1.3.5 Western blot检测CHOP、Caspase-3蛋白表达 运用RIPA裂解液（含蛋白酶按捺剂PMSF）提取心肌組织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，每孔50 μg蛋白行SDS-PAGE电泳，半干转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温关闭1 h，一抗4℃孵育过夜（anti-CHOP抗体，1∶1000；anti-Caspase-3抗体，1∶1000），荧光二抗（1∶5000）室温避光孵育1 h，运用Odyssey双色红外激光成像体系扫描，Quantity One软件（Bio-Rad，USA）丈量条带灰度值，以内参GAPDH校正后的灰度值比值表明蛋白相对表达水平。
1.4计算学剖析
选用SPSS 19.0计算软件进行数据剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）表明，两组间比较选用成组t查验，多组间比较选用单要素方差剖析，相关性剖析选用Pearson相关性剖析，以P<0.05为差异有计算学含义。
2成果
2.1各组不一起刻点心功用改动的比较
与Sham组比较，CME组各时刻点心功用均不同程度下降，表现为LVEF、FS、CO下降及LVEDD添加，差异均有计算学含义（P<0.05）。Sham组内不一起刻点的心功用目标比较，差异无计算学含义（均P>0.05）。CME组内比较：LVEF 12 h组、FS 12 h组、LVEDD 12 h组与其他时刻点比较，差异有计算学含义（P<0.05）；LVEF 6 h组、FS 6 h组与24 h组及48 h比较，差异有计算学含义（P<0.05）（表1）。
表1 各组不一起刻点心功用目标动态改动的比较（x±s）
与Sham组相应时刻点比较，aP<0.05；与CME后3、6、24、48 h比较，bP<0.05；与CME后24、48 h比较，cP<0.05
2.2 CME后心肌安排病理学改动剖析
HE染色示微栓塞球沿微血管走行散布，周围可见心肌微梗死灶，多为楔形，呈局灶性散布，微梗死灶心里肌细胞核溶解或消失，胞质红染，周围心肌水肿，炎性细胞滋润显着（图1）。HBFP染色示Sham组偶见心内膜下缺血，无显着心肌梗死。CME组各时刻点均可见显着多发性局灶性心肌微梗死，非透壁性，以心内膜下及左心室多见。CME组各时刻点心肌微梗死面积比较，差异无计算学含义（P>0.05）（图2）。
a b
a：Sham组12 h；b：CME组12 h
与Sham组比较，CME组可见显着微梗死灶，周围炎性细胞滋润。箭头所指为微栓塞球
图1 猪CME后12h心肌安排病理学改动（HE染色，×100）
a b
a：Sham组12 h；b：CME组12 h
正常安排呈黄色，缺血或梗死安排呈赤色。黑色箭头所指为微栓塞球，白色箭头所指为红染的微梗死灶
图2 猪CME后心肌安排微梗死（HBFP染色，×100）
2.3 CME后心肌细胞凋亡改动剖析
选用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，阳性染色信号定坐落心肌细胞核内，凋亡细胞呈棕黄色，正常心肌细胞核呈淡蓝色。Sham组心内膜下少量散在散布的凋亡细胞，各时刻点比较差异无计算学含义（P>0.05）。与相应Sham组比较，CME组各时刻点心肌细胞凋亡指数均不同程度上升（P<0.05）。凋亡心肌细胞首要坐落微梗死灶内及其周边。CME后3 h心肌细胞凋亡指数升高，6 h升高更显着，12 h达顶峰，24 h呈下降趋势，48 h已显着下降，但仍较Sham组为高（图3）。
a～f别离为sham组12 h、CME组3 h、CME组6 h、CME组12 h、CME组24 h及CME组48 h与Sham组各时刻点比较，aP<0.05；与CME后3、6、24、48 h组比较，bP<0.05；与CME后6、24、48 h组比较，cP<0.05
图3 不一起刻点心肌细胞凋亡指数（×400）
2.4 CME后心肌安排CHOP、Caspase-3蛋白表达改动
Sham组不一起刻点的CHOP、Caspase-3蛋白表达差异无计算学含义（P>0.05）。与相应Sham组比较，CME组各时刻点的心肌安排CHOP、Caspase-3蛋白表达均不同程度升高（P<0.05），呈动态改动，CME后12 h表达达顶峰（图4、图5）。
与相应时刻点Sham组比较，aP<0.05；与CME组3、6、24、48 h组比较，bP<0.05；与CME组3、48 h组比较，cP<0.05
图4 Western blot 检测sham组及CME组不一起刻点CHOP蛋白相对表达水平
与相应时刻点Sham组比较，aP<0.05；与CME组3、6、24、48 h组比较，bP<0.05；与CME组3、6、48 h组比较，cP<0.05
图5 Western blot 检测Sham组及CME组不一起刻点Caspase-3蛋白相对表达水平
2.5相关性剖析
CME组各时刻点心肌细胞凋亡指数与CHOP、Caspase-3蛋白表达呈正相关联系（别离为r=0.615，P<0.05；r=0.901，P<0.05），与首要心功用目标LVEF呈负相关联系（r=-0.509，P<0.05）。
3评论
本试验研讨成果提示，猪CME后心功用下降，心肌细胞凋亡指数添加，CHOP蛋白表达上调，呈动态改动。相关性剖析提示心肌细胞凋亡指数与CHOP蛋白表达呈显着正相关。心肌细胞凋亡可能与CME后内质网应激相关蛋白CHOP表达上调有关。
CME是PCI术中常见且扎手的并发症，可导致无复流现象的发作，是患者远期预后不良的激烈猜测因子[10-11]。临床研讨及动物试验研讨提示，CME可导致恶性心律失常，冠脉血流储藏下降，心功用进行性恶化，血清心肌损害标志物升高，安排病理学提示心肌微梗死及细胞凋亡[12]。凋亡是受多基因严厉调控的自主的程序性细胞逝世，心肌细胞凋亡参加多种心血管疾病病理生理进程，包含急性心肌梗死、缓慢心力衰竭及心肌缺血再灌注损害等[13]。笔者近期的研讨提示，CME后存在心肌细胞凋亡，按捺心肌细胞凋亡可改进CEM后心功用，提示凋亡为CME致心肌损害重要机制之一[14-15]。
现在已知的3条凋亡调控通路中，内质网应激介导的凋亡途径是新近发现的凋亡信号通路，且益发遭到重视[16]。内质网是蛋白折叠、钙體内平衡及脂质生物组成的细胞器。多种病理要素（如氧化应激、缺血、Ca2+耗竭、蛋白转运反常等）影响内质网腔未折叠蛋白或过错折叠蛋白的集合导致内质网功用障碍，即内质网应激。细胞经过发动未折叠蛋白反响以削减蛋白组成、添加未折叠蛋白降解，然后使细胞习惯内质网应激。但是，假如内质网应激过强或继续存在，细胞便可发动凋亡信号通路，如诱导促凋亡转录因子CHOP表达、活化c-Jun氨基结尾激酶（JNK）及胱天蛋白酶-12（Caspase-12）。现在的研讨提示，未折叠蛋白反响及内质网介导的细胞凋亡参加多种心血管疾病病理生理进程，如心力衰竭、心肌缺血再灌注损害及动脉粥样硬化[17-18]。CHOP是内质网凋亡途径中要害的转录因子之一，在生理状态下，CHOP表达极低[19-20]。Thorp等[21]的研讨发现，CHOP-/-小鼠与CHOP+/+小鼠及Ldlr-/-小鼠杂交子孙比较，斑块的坏死及凋亡均明显削减，提示内质网应激发动的CHOP表达上调与斑块的坏死、凋亡密切相关。本试验研讨成果显现，猪CME后3 h CHOP蛋白表达上调，6 h上调更明显，12 h达顶峰，24～48 h呈继续性下降，但仍较相应时刻点假手术组为高。其动态改动规则与CME后心肌细胞凋亡动态改动契合，提示CHOP介导的内质网应激可能参加CME致心肌细胞凋亡。
综上所述，CME急性期心肌细胞凋亡呈动态改动，12 h达顶峰，内质网应激相关蛋白CHOP表达上调可能参加CME致心肌细胞凋亡。CHOP有望成为防治CME致心肌损害的新靶点。
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（收稿日期：201711-10 本文編辑：祁海文）
