肖梦杰++肖学成++薛大权+++崔开宇++涂皓++吴莹++朱雅莲
[摘要]意图 树立HPLC法测定醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑有关物质的办法。办法 选用ZORBAX Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）为色谱柱，以甲醇-0.077%醋酸铵溶液（20∶80）为活动相A，以甲醇-乙腈（40∶60）为活动相B，进行梯度洗脱，检测波长为225 nm；流速1.0 ml/min；柱温为35℃。成果 硝酸益康唑与各杂质别离度杰出，硝酸益康唑在0.2～100.0 μg/ml的浓度范围内峰面积与浓度之间呈杰出的线性关系，回归方程为y=15.6295x+4.5920（r=0.999 97）。定论 此办法测定醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的有关物质简略可行。
[关键词]醋酸曲安奈德益康唑乳膏；硝酸益康唑；有关物质；HPLC
[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（c）-0011-05
Determination of Econazole Nitrate related substances in Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream
XIAO Meng-jie XIAO Xue-cheng XUE Da-quan▲ CUI Kai-yu TU Hao WU Ying ZHU Ya-lian
College of Pharmacy，Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430065，China
[Abstract]Objective To establish a HPLC method for the determination of related substances of Econazole Nitrate in Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream.Methods The ZORBAX Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm） column was adopted.The mobile phase consisted of a mixture of Methanol-0.077% solution of Ammonium Acetate （20：80） as mobile phase A，a mixture of Methanol-Acetonitrile （40：60） as mobile phase B，which was used as gradient elution.The detection wavelength was 225 nm.The flow rate was 1.0 ml/min，and the column temperature was 35℃.Results Econazole Nitrate was well separated from impurity.The calibration curves was linear in range of 0.2-100.0 μg/ml for Econazole Nitrate，the regression equation was y=15.6295x+4.5920 （r=0.999 97）.Conclusion This method is simple and feasible to determine the related substances of Econazole Nitrate in Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream.
[Key words]Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream；Econazole Nitrate；Related Substances；HPLC醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑為广谱抗真菌药，醋酸曲安奈德为糖皮质激素，醋酸曲安奈德益康唑乳膏对皮炎、湿疹、皮肤细菌感染和皮肤浅表真菌感染伴有显着炎症反响作用切当[1-9]。因为在曲安奈德益康唑乳膏（Ⅱ）（醋酸曲安奈德益康唑乳膏）国家规范WS1-（X-320）-2004Z、《我国药典》[10]录入的曲安奈德益康唑乳膏、硝酸益康唑乳膏质量规范中均未对产品的有关物质进行操控，为了更好地进步产品质量，经过醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的杂质研讨[11-13]，并参阅EP规范[14]和《我国药典》规范中硝酸益康唑原料药有关物质的查看办法，对醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的有关物质进行了操控。
1仪器与试药
1.1仪器
KNAUER S-2500高效液相色谱仪（德国诺尔）和相应的工作站；TU-1810紫外-可见分光光度计（北京谱析）；Acculab ALC-110.4剖析天平；水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；ORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）色谱柱。
1.2试药
醋酸曲安奈德益康唑乳膏样品由武汉诺安药业有限公司试制，批号：20160701、20160702、20160703；空白辅料样品（克己，除不含有硝酸益康唑外，其他成分均与样品共同）；市售醋酸曲安奈德益康唑乳膏（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：15061701，商名品：吉佰芙）；硝酸益康唑对照品（由我国食品药品检定研讨院供给，批号：100214-201204，含量为99.6%）；硝酸益康唑体系适用性对照品（由欧洲药典委员会供给，批号：006PA0，含硝酸益康唑和杂质A、B、C）；硝酸益康唑杂质A对照品（由Cato Research Chemicals Inc供给，批号：C3D-2013-1503，含量为98.8%）；硝酸益康唑杂质B对照品（由Cato Research Chemicals Inc供给，批号：C4X-13272-1501，含量为99.8%）；硝酸益康唑杂质C对照品（由Cato Research Chemicals Inc供给，批号：C4X-13273-1412，含量为99.7%）。甲醇、乙腈为色谱纯；其他均为剖析纯。
2办法与成果
2.1色谱条件
选用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）为色谱柱，以甲醇-0.077%醋酸铵溶液（20∶80）为活动相A，以甲醇-乙腈（40∶60）为活动相B，检测波长为225 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为35℃；进样量为20 μl，梯度洗脱见表1。
2.2溶液的制备
2.2.1样品溶液 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精细称定，置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在冰浴中冷却1 h后当即过滤，取续滤液放置至室温，备用。
2.2.2对照品溶液 取硝酸益康唑对照品约10 mg，精细称定，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为硝酸益康唑对照品储藏液；取硝酸益康唑体系适用性对照品适量，精细称定，用甲醇稀释成浓度约为1 mg/ml的对照品溶液；别离取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品约10 mg，精细称定，用甲醇别离稀释成浓度约为10 μg/ml的对照品溶液。
2.2.3空白辅料对照溶液 取空白辅料样品乳膏2.5 g，精细称定，制备办法同“2.2.1”项下。
2.3专特点调查
取空白溶剂（甲醇）、空白辅料、体系适用性溶液及供试品溶液别离按上述色谱条件进样，进行专特点调查，成果显现溶剂和空白辅料对主峰及杂质的检测均无搅扰。标明该活动相用于醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的有关物质的检测具有必定的专特点，色谱图见图1～4。
2.4损坏实验
2.4.1酸损坏 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精细称定，置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷。加1 mol/L的盐酸溶液2.5 ml，摇匀，避光放置2 h后，用1 mol/L氢氧化钠溶液2.5 ml中和，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在冰浴中冷却1 h后当即过滤，取续滤液放置至室温，备用。
2.4.2碱损坏 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精细称定，置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷。加1 mol/L的氢氧化钠溶液2.5 ml，摇匀，避光放置2 h后，用1 mol/L盐酸溶液2.5 ml中和，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在冰浴中冷却1 h后当即过滤，取续滤液放置至室温，备用。
2.4.3光损坏 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精细称定，置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷。用甲醇稀释至刻度，摇匀，置4500 Lx的强光下照耀48 h，然后在冰浴中冷却1 h后当即过滤，取续滤液放置至室温，备用。
2.4.4热损坏 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精细称定，置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷。用甲醇适量移至25 ml量瓶中， 再将量瓶置100℃水浴中损坏2 h（每距离半小时加甲醇1次）后，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在冰浴中冷却1 h后当即过滤，取续滤液放置至室温，备用。
2.4.5氧化损坏 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精细称定，置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷。参加30%的H2O2 2.5 ml，摇匀，避光放置2 h后，于80℃水浴中加热2 min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在冰浴中冷却1 h后当即过滤，取续滤液放置至室温，备用。
按上述色谱条件，别离取制剂的酸、碱、光、热、氧化损坏溶液进样，记载色谱图，见图5～9，成果标明：①醋酸曲安奈德益康唑乳膏的酸、碱、光、热、氧化损坏溶液进样，各降解产品峰之间、各降解产品峰与主峰之间、各降解产品峰与辅料峰之间的别离度均符合规则；②醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑对光照损坏较安稳，对酸、碱、氧化和高温损坏均活络，其间，热损坏和碱损坏将制剂中的另一主药醋酸曲安奈德和抗氧剂BHA已彻底损坏，损坏后降解发生的物质共同核算为硝酸益康唑热损坏降解杂质。
2.5精细度实验
取“2.2.1”项下同一供试品溶液，在上述色谱条件下接连进样6针。成果，醋酸曲安奈德益康唑乳膏中单个最大杂质峰面积的RSD=0.44%（n=6），各杂质峰面积和的RSD=0.44%（n=6），标明本办法重复性杰出。
2.6样品溶液安稳性
取“2.2.1”项下同一供试品溶液，放置于25℃恒温箱中，于0、1、2、4、6、8 h后进样测定。成果，醋酸曲安奈德益康唑乳膏中最大杂质峰面积的RSD=0.13%（n=6），各杂质峰面积和的RSD=0.74%（n=6），标明供試品溶液在8 h内比较安稳。
2.7定量限及检测限调查
取“2.2.1”项下硝酸益康唑对照储藏液，逐渐稀释，定量限按信噪比10∶1计为0.3 ng，检测限按信噪比3∶1计为0.1 ng。
2.8重复性实验
取“2.2.1”项下硝酸益康唑对照储藏液，接连进样6针，成果，硝酸益康唑峰面积RSD=0.11%（n=6），标明本办法重复性杰出。
2.9线性关系实验
取硝酸益康唑对照品储藏液， 以甲醇为溶剂，别离配制成含硝酸益康唑约为0.2、1.0、2.0、10、100 μg/ml的系列对照品溶液，按上述拟定的色谱条件别离进样，记载色谱图。以硝酸益康唑的均匀峰面积为纵坐标，以硝酸益康唑的浓度为横坐标，进行线性回归，回归方程为y=15.6295x+4.5920（r=0.999 97），成果标明，硝酸益康唑溶液在0.2～100.0 μg/ml的浓度范围内峰面积与浓度之间呈杰出的线性关系。
2.10试制样品与市售样品的有关物质查看
精细称取批号为20160701、20160702、20160703三批样品及市售样品各2.5 g，别离置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷，定容，滤过取续滤液作为供试品溶液。精细量取供试品溶液1 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照上述断定色谱条件查看，已知杂质按外标法，不知道杂质按主成分本身对照法核算其有关物质，成果见表2。
3评论
3.1检测波长的挑选
因硝酸益康唑与醋酸曲安奈德的最大吸收波长及色谱条件存在必定的差异，为了更活络地检出产品的杂质品种及精确操控杂质的极限，依照两主成分原料药项下的有关物质查看办法别离进行有关物质的检测，硝酸益康唑在200～400 nm的波长范围内扫描，其最大吸收波长为220 nm，参阅硝酸益康唑原料药《欧洲药典》规范和《我国药典》规范中有关物质的检测波长为225 nm，所以断定将225 nm作为检测波长。
3.2杂质的相对保存时刻
取硝酸益康唑体系适用性对照品溶液、杂质A对照品溶液、杂质B对照品溶液及杂质C对照品溶液，按上述色谱条件，别离接连进样2针，成果，体系适用性溶液中杂质A、B、C与主峰的相对保存时刻别离约为0.3、0.7、0.9，与EP规范中规则的杂质A、B、C与主峰的相对保存时刻约为0.2、0.6、1.1不共同。张慧文等[15]研讨标明，用不同品牌的C18色谱柱，杂质A、B、C的出峰方位和出峰次序有可能不同，所以用相对保存时刻对杂质A、B、C进行定位不精确。
3.3杂质的极限
比照硝酸益康唑原料药的《欧洲药典》规范和《我国药典》规范中有关物质的检测办法，在杂质极限操控中，《欧洲药典》规范更严厉，在《欧洲药典》规范中别离收载了三个已知杂质，别离为杂质A、B、C，并拟定了极限，清晰了结构式，而在《我国药典》规范中未进行具体的规则；别的，《欧洲药典》规范中对不知道单杂和总杂的极限较《我国药典》规范更严，核算办法均为不加校对因子的主成分本身对照法。考虑到本品为外用制剂，参阅《我国药典》结合3批样品和市售样品的查验成果，拟定的杂质极限与硝酸益康唑《我国药典》质量规范共同，即单个不知道杂质的极限为0.2%，总杂为0.5%。
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（收稿日期：2017-01-02 本文修改：方菊花）
