谢文剑+曹艺+柏玉冰等
[摘要] 意图 树立夏枯草药材中熊果酸含量的超高效液相色谱法（UPLC）测定办法。 办法 选用UPLC进行测定，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以甲醇-0.5%冰乙酸水为活动相进行等度洗脱，流速为0.3 ml/min，柱温30℃，检测波长210 nm。 成果 熊果酸在0.2461～0.4922 mg规模内呈杰出的线性关系（r2=0.9999），均匀回收率为99.29%，RSD=1.74%，熊果酸在夏枯草中的含量为0.28%～0.53%。 定论 该办法快速、高效、重现性好，可认为夏枯草药材的质量操控供给更有用的手法。
[关键词] 夏枯草；熊果酸；超高效液相色谱法；含量测定
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）10（a）-0011-03
夏枯草为唇形科植物夏枯草（Prunella vulgaris L.）的枯燥老练果穗，味辛、苦，性寒，具有清肝泻火、明目、散结消肿之成效[1]。夏枯草的首要化学成分有三萜、黄酮、甾体、香豆素、蒽醌、苯丙素等[2]。其间的首要成分熊果酸具有冷静、抗溃疡、下降血糖、抗炎、抗菌等多种生物学效应[3-5]。近年来，又发现熊果酸具有按捺癌细胞增加、搬运和诱导癌细胞凋亡等效果，极有可能成为一种新式抗癌药物[6-8]。别的，熊果酸还具有显着的抗氧化功用，被广泛用作医药和化妆品质料[9]。
现在关于夏枯草药材的质量操控研讨首要是以熊果酸、齐墩果酸和迷迭香酸等的HPLC含量测定和夏枯草药材的HPLC指纹图谱为主[10-14]，关于夏枯草超高效液相色谱法（UPLC）含量测定的研讨还未有报导，且比较于传统的HPLC而言，UPLC具有柱效高、别离度好和别离快等长处，大大缩短了样品运转的时刻，能够满意当下高通量剖析的要求。因而，本试验选用UPLC树立夏枯草药材中熊果酸含量测定办法[15]，测定不同批次的夏枯草药材中熊果酸的含量，该办法灵敏度高，别离度好，重现性好，可认为夏枯草药材的质量操控供给更有用的手法。
1 试验资料
1.1 仪器
SK3300H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），T-214型电子剖析天平（Denver公司），Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱体系、Empower工作站、四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器（Waters 公司）。
1.2 试剂
甲醇（色谱纯，Sigma公司），冰乙酸（色谱纯，天津市化学试剂研讨所），水为怡宝纯净水。对照品熊果酸为本课题组克己，纯度>98%。
1.3 资料
15份夏枯草样品均由广州白云山星群（药业）股份有限公司供给，经中药判定教研室龚力民教师判定为唇形科植物夏枯草。
2 办法与成果
2.1 色谱条件
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以甲醇-0.5%冰乙酸水（80∶20）为活动相体系进行等度洗脱，检测波长为210 nm，流速0.3 ml/min，柱温30℃，进样量1 μl。
2.2 对照品溶液的制备
精细称取熊果酸对照品10.70 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇10 ml定容至刻度，密塞，摇匀，即得（每毫升对照品溶液含熊果酸1.07 mg）。
2.3 供试品溶液的制备
称取夏枯草粉末约1.0 g，精细称定，置于100 ml具塞锥形瓶中，参加甲醇10 ml，密塞超声30 min，放冷至室温，用甲醇补足分量，摇匀，0.22 μl微孔滤膜滤过，即得。
2.4 线性关系调查
精细汲取对照品溶液0.2、0.25、0.35、0.4、0.5 ml，别离置于1 ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。别离取对照品溶液1 μl注入UPLC色谱仪，按上述色谱条件测定熊果酸峰面积积分值，以对照品峰面积积分值为纵坐标，对照品含量为横坐标制作规范曲线。核算熊果酸的回归方程：Y=1.10×106X+6.93×104（r2=0.9997），线性规模0.2461～0.4922 mg。
2.5 办法学调查
2.5.1 精细度试验 取同一对照品溶液，重复进样6次，进样体积1 μl，按上述色谱条件测定熊果酸峰面积积分值，核算峰面积的RSD=1.47%，标明本办法精细度杰出，契合办法学调查要求。
2.5.2 稳定性试验 取同一对照品溶液，别离在0、2、4、8、12、24 h进样，进样体积1 μl，按上述色谱条件测定熊果酸峰面积积分值，核算24 h内峰面积的RSD=1.62%，标明熊果酸在24 h内稳定性杰出。
2.5.3 重复性试验 取同一批夏枯草样品6份，每份约1.0 g，精细称定，按上述供试品溶液的制备办法制备。取1 μl注入UPLC色谱仪，在上述色谱条件下测定熊果酸峰面积积分值，核算熊果酸峰面积的RSD=1.54%，标明熊果酸重复性杰出。
2.5.4 加样回收率试验 取已知熊果酸含量的夏枯草粉末6份，每份约0.5 g，精细称定，别离参加熊果酸对照品适量，按上述供试品溶液制备办法制备。别离取样品供试液1 μl注入UPLC色谱仪，测定熊果酸峰面积积分值，核算均匀回收率为99.29%，RSD=1.74%，标明本办法加样回收率杰出（表1）。
2.6 含量测定
取不同批次的夏枯草样品，每份约1.0 g，精细称定，按上述供试品溶液制备办法制备。别离取样品供试液1 μl注入UPLC色谱仪，测定熊果酸峰面积积分值，核算15份供试品溶液中熊果酸的含量（表2），对照品及样品色谱图见图1。
3 评论
本试验调查了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6种不同提取溶剂，根据熊果酸峰面积断定了甲醇为提取溶剂。别离调查了10、15、20、25、30 ml五个体积，成果标明，提取溶剂体积为15 ml时，提取夏枯草样品中熊果酸的功率最佳。比较超声与回流两种提取办法，超声提取的功率要高于回流提取的提取率，故挑选超声提取。别离调查不同超声时刻15、30、45、60 min，断定超声时刻为45 min。
对夏枯草中化学成分研讨标明，其所含的三萜酸类成分首要为熊果酸和齐墩果酸。两者为同分异构体，结构极为类似，仅在C19和C20上有一个甲基方位的差异，给别离带来必定难度，且熊果酸、齐墩果酸中无共轭体系，紫外吸收波长较短。在210 nm处，熊果酸的吸收峰灵敏度较高，其他色谱峰的搅扰较小，别离最为抱负，故挑选检测波长为210 nm，测定熊果酸的含量。
不同产地夏枯草中熊果酸的含量存在的不同较大，这可能是因为不同收集地址成长环境的不同，药材的成长年限、采收时节、原产地加工也均存在差异。因而，应留意有用成分含量的不同，严厉规则夏枯草药材的成长期、采收期，以确保临床用药的安全有用性。
本研讨所树立的夏枯草中有用成分熊果酸的含量测定办法快速、精确，与传统的HPLC测定办法比较，样品的运转时刻大大缩短，峰形与别离度均较好。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.我国药典2010年版一部[M].北京：我国医药科技出版社，2010：263.
[2] 王祝举，赵玉英，涂光忠，等.夏枯草化学成分的研讨[J].药学学报，1999，34（9）：679-681.
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[14] 方罗，林能明，吴永江.高效液相色谱一起测定夏枯草药材中4种活性成分的含量[J].我国中药杂志，2010， 35（5）：616-619.
[15] 沈盼盼，谢晓梅，张圣龙，等.UPLC法测定宣木瓜中齐墩果酸、熊果酸[J].南京中医药大学学报，2013，29（3）：271-273.
（收稿日期：2014-07-11 本文修改：林利利）
3 评论
本试验调查了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6种不同提取溶剂，根据熊果酸峰面积断定了甲醇为提取溶剂。别离调查了10、15、20、25、30 ml五个体积，成果标明，提取溶剂体积为15 ml时，提取夏枯草样品中熊果酸的功率最佳。比较超声与回流两种提取办法，超声提取的功率要高于回流提取的提取率，故挑选超声提取。别离调查不同超声时刻15、30、45、60 min，断定超声时刻为45 min。
对夏枯草中化学成分研讨标明，其所含的三萜酸类成分首要为熊果酸和齐墩果酸。两者为同分异构体，结构极为类似，仅在C19和C20上有一个甲基方位的差异，给别离带来必定难度，且熊果酸、齐墩果酸中无共轭体系，紫外吸收波长较短。在210 nm处，熊果酸的吸收峰灵敏度较高，其他色谱峰的搅扰较小，别离最为抱负，故挑选检测波长为210 nm，测定熊果酸的含量。
不同产地夏枯草中熊果酸的含量存在的不同较大，这可能是因为不同收集地址成长环境的不同，药材的成长年限、采收时节、原产地加工也均存在差异。因而，应留意有用成分含量的不同，严厉规则夏枯草药材的成长期、采收期，以确保临床用药的安全有用性。
本研讨所树立的夏枯草中有用成分熊果酸的含量测定办法快速、精确，与传统的HPLC测定办法比较，样品的运转时刻大大缩短，峰形与别离度均较好。
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（收稿日期：2014-07-11 本文修改：林利利）
3 评论
本试验调查了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6种不同提取溶剂，根据熊果酸峰面积断定了甲醇为提取溶剂。别离调查了10、15、20、25、30 ml五个体积，成果标明，提取溶剂体积为15 ml时，提取夏枯草样品中熊果酸的功率最佳。比较超声与回流两种提取办法，超声提取的功率要高于回流提取的提取率，故挑选超声提取。别离调查不同超声时刻15、30、45、60 min，断定超声时刻为45 min。
对夏枯草中化学成分研讨标明，其所含的三萜酸类成分首要为熊果酸和齐墩果酸。两者为同分异构体，结构极为类似，仅在C19和C20上有一个甲基方位的差异，给别离带来必定难度，且熊果酸、齐墩果酸中无共轭体系，紫外吸收波长较短。在210 nm处，熊果酸的吸收峰灵敏度较高，其他色谱峰的搅扰较小，别离最为抱负，故挑选检测波长为210 nm，测定熊果酸的含量。
不同产地夏枯草中熊果酸的含量存在的不同较大，这可能是因为不同收集地址成长环境的不同，药材的成长年限、采收时节、原产地加工也均存在差异。因而，应留意有用成分含量的不同，严厉规则夏枯草药材的成长期、采收期，以确保临床用药的安全有用性。
本研讨所树立的夏枯草中有用成分熊果酸的含量测定办法快速、精确，与传统的HPLC测定办法比较，样品的运转时刻大大缩短，峰形与别离度均较好。
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（收稿日期：2014-07-11 本文修改：林利利）
