何婷玉+++杜玉文+++陈肖楠+等
[摘要] 意图 评论siRNA缄默沉静DNA聚合酶β（polβ）基因表达对食管癌EC9706细胞放疗灵敏性的影响。 办法 运用脂质体将siRNA转染至EC9706细胞，选用实时荧光定量PCR检测3组不同转染的细胞中polβ mRNA的表达改变；不同剂量（0、2、4、6、8 Gy）照耀3组细胞，CCK8办法检测各组细胞的存活率；用3 Gy照耀，流式细胞术检测每组细胞的凋亡率。 成果 转染缄默沉静polβ组polβ基因表达水平显着下降（P<0.01）；CCK8检测成果显现，跟着照耀剂量的添加，细胞存活率呈下降趋势，其间缄默沉静polβ组细胞存活率显着低于两个对照（P<0.05）；缄默沉静polβ组细胞凋亡率显着高于无关siRNA组或空白对照组（P<0.01），照耀后缄默沉静polβ组细胞的凋亡率添加量显着高于无关siRNA组和空白对照组（P<0.01）。 定论 缄默沉静食管癌细胞polβ基因表达可添加其对放疗的灵敏性。
[关键词] 聚合酶β；siRNA；食管癌；放疗灵敏性
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）08（c）-0004-04
DNA聚合酶β（DNA polymerase β，polβ）是一种广泛存在于哺乳动物核内的单链小分子蛋白质，归于DNA聚合酶宗族中的一员[1]，在DNA组成、损害及修正中起关键效果[2]，该酶的稳定性较差，催化活性较低，催化反响进程易受多种要素影响，是仿制保真度较低的DNA聚合酶[3]，一系列的DNA体外仿制试验也证明了polβ基本不参加DNA仿制，而可能在DNA损害修正进程中起必定的效果，如参加碱基切除修正进程（base excision repair，BER）[4]。针对polβ基因的不同特性，国内外不同学者对其进行了不同的研讨，其间有成果显现，polβ在射线、烷化剂等诱导的DNA单链断裂（single strand break，SSB）修正中起重要效果[5]，也有研讨显现，在肿瘤放射医治进程中，polβ作为重要修正因子调控着肿瘤细胞对放疗的灵敏性。本课题组前期研讨中发现，polβ在食管癌安排中高表达，本研讨进一步评论了缄默沉静polβ基因的表达对食管癌细胞株放疗灵敏性的影响。
1 资料与办法
1.1 试验资料
人食管癌细胞EC9706（郑州大学根底医学院保存），胎牛血清、1640培育基、胰蛋白酶（均购置于美国Gibco公司），RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂和Taq DNA聚合酶（加拿大Fermentas 公司）。polβ引物、GAPDH引物（上海生工技能有限公司）。
1.2 siRNA的规划与组成
参阅GenBank中polβ基因的编码序列（NM_002 690），运用网上规划软件（www.dharmacon.com）规划出siRNA、siRNA-polβ和siRNA-scramble，详细序列别离为：5′-GAACGTGAGCCAAGCTATC-3′和5′-GAGTAACCGATAGCGCATC-3′，由Ambion公司组成。
1.3 细胞培育和转染
于37℃、5%CO2、饱和湿度的培育箱中，用含10%胎牛血清、双抗（1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素）的1640培育基培育EC9706细胞，细胞贴满培育瓶瓶底约75%时可传代培育。试验挑选对数成长期细胞。将搜集的细胞悬液接种于六孔板，每孔5×104个细胞，给予新鲜彻底培育基培育至细胞融合度挨近50%～80%时进行转染。脂质体转染依据Lipofectamine 2000运用说明进行，试验分为3组：缄默沉静polβ组、无关siRNA对照组、空白对照组。转染后细胞饥饿24 h进行后续试验。
1.4 X线照耀
VARIAN直线加速器6 MV-X射线照耀，剂量率为2 Gy/min，源皮距100 cm，照耀野10 cm×10 cm，培育板下置1 cm等效安排填充物。
1.5 RT-PCR检测 polβ mRNA的表达
搜集3组细胞，别离提取总RNA（Invitrogen），Nanadrop 2000荧光分光光度计测定RNA样品的浓度和纯度。运用First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒以Oligo dT为引物逆转录组成cDNA。PCR选用TaqMan办法检测polβ mRNA表达，Primer Premier 5.0软件规划引物，polβ上游5′-GTGCAGAGTCCAG-TGGTGACA-3′；polβ下流5′-CAGTTTTGGCTGTTTGGTTGATT-3′；探针序列：5′-FAM-ATGTTCTCCTGACCCATCCCAGCTTCAC-TAMMR-3′。内参β-actin引物：上游5′-TTCACTTCTTCAGTTCTGCCATCT-3′；下流5′-CCAAGCTTTTCTCAGTCCCATAA-3′；探针序列：5′-FAM-TCAAAGGGCTCCAGCCTCACTCAGTC-TAMMR-3′。PCR反响条件：50℃ 2 min、95℃ 2 min、95℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，45个循环。2-ΔΔCt法剖析样品中意图基因的相对表达率。
1.6 CCK8检测EC9706细胞的放射灵敏性
细胞增殖测定选用细胞计数试剂盒8（Dojindo，Gaithersburg，MD）依据其说明书进行操作。别离取转染后呈对数成长的3组细胞，选用不同剂量（0、2、4、6、8 Gy）X线照耀，PBS清洗，胰酶消化，PBS洗刷后混悬细胞，调整细胞浓度为5×103个/μl转入96孔板中，每组设6个复孔，置于37℃、5%CO2细胞培育箱中，连续培育2 d，在最终4 h加每孔10 μl CCK8溶液。持续培育4 h后，于分光光度计450 nm波利益丈量吸光值，依据吸光值推测出不同处理组的活细胞数目，核算细胞存活率。
1.7 流式细胞仪检测EC9706细胞凋亡
细胞凋亡检测运用Annexin V-FICT/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（Abcam），依据其说明书进行操作。取转染后呈对数成长的3组细胞，每组细胞分2个小组，一小组选用3 Gy X线照耀，另一个小组作为对照，胰酶消化，PBS洗刷后混悬细胞，调整每管细胞浓度为1×106个/ml，顺次参加Annexin V-FICT和碘化丙啶（PI）试剂，室温，避光15 min后，即选用流式细胞仪检测（Becton Dickinson）。
1.8 统计学处理
选用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，各组参数的比较用One-way ANOVA进行方差剖析和显着性查验，两两比较选用LSD查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 RT-PCR检测转染后polβ mRNA的相对表达量
搜集转染后各组细胞，提取总RNA，选用实时定量RT-PCR的办法，对各处理组polβ mRNA表达水平进行检测，发现缄默沉静polβ组polβ mRNA相对表达量与无关siRNA对照组、空白对照组比较均显着下降（P<0.01），无关siRNA对照组、空白对照组比较差异无统计学含义（P=0.913）2.2 CCK8法检测细胞放射灵敏性的成果
选用CCK8法检测各处理组细胞的存活率发现，跟着照耀剂量的添加，细胞存活率呈下降趋势，其间缄默沉静polβ组下降趋势较显着，且在不同剂量照耀时均与无关siRNA对照组、空白对照组差异有统计学含义（P<0.05），无关siRNA组与空白对照组间差异无统计学含义（P>0.05）2.3 流式细胞术检测细胞凋亡的成果
缄默沉静polβ组（凋亡率为7.3%）较无关siRNA组（3.8%）或空白对照组（3.2%）细胞凋亡添加，差异有统计学含义（P<0.05），而缄默沉静polβ转染联合照耀组（17.8%）与缄默沉静polβ组、无关siRNA组、空白对照组或无关siRNA转染联合照耀组（11.2%）、空白组联合照耀组（10.6%）比较，细胞凋亡添加更为显着，差异有统计学含义（P<0.01），提示缄默沉静polβ能够诱导EC9706细胞的凋亡，且可添加细胞对放疗的灵敏性。
3 评论
食管癌是全球最常见的六大恶性肿瘤之一，全世界每年约有30万人死于食管癌。我国是世界上食管癌高发区域之一，每年均匀病死约15万人，居恶性肿瘤的第4位。食管癌患者的预后较差，大都食管癌患者在确诊时已发作部分侵袭或远处搬运，手术往往难以进行，而只能挑选姑息性医治，放射医治是食管癌首要的姑息性医治办法之一，但放疗后的临床效果却不尽人意，5年生存率仅为10%～30%，肿瘤部分未控率和复发率高达60%～80%[6]。进步食管癌放疗的效果是现在研讨者重视的热门。近年来国内外的研讨发现，多种基因及其表达产品，如细胞周期调控基因[7]、凋亡基因[8-9]、DNA损害修正蛋白[10-11]等，影响肿瘤放射灵敏性。DNA损害修正体系存在于一切细胞中，且在肿瘤细胞中已被证明是反抗放疗或导致肿瘤细胞对放疗不灵敏的重要机制之一，作为DNA损害修正体系中重要的一员，polβ调控肿瘤细胞的放射医治灵敏性是国内外研讨的热门。
RNA搅扰是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因缄默沉静机制，小片段搅扰性RNA经过序列特异性的降解效果，能有用关闭靶mRNA和下降蛋白水平[12]。RNAi技能的开展日趋老练，凭仗其高稳定性、高效性、高特异性、可遗传性、可分散性等特色，该技能已经成为一种基因功能研讨的重要东西[13]。Bentley等[14]发现，选用RNAi技能能够显着按捺膀胱癌细胞的侵袭才能；还有研讨发现，运用RNAi技能下调相应靶蛋白表达后，细胞的放疗灵敏性显着增强[15-16]。
根据以上研讨布景，本课题组在前期研讨中发现，polβ在食管癌安排中高表达的根底上，挑选缄默沉静polβ基因转染食管癌细胞，评论其对食管癌细胞株放射医治灵敏性的影响。经过RT-PCR技能证明了siRNA-polβ显着按捺了polβ基因的表达，选用CCK8办法检测到缄默沉静polβ组的食管癌细胞对放射医治的灵敏性较无关siRNA组、空白对照组有显着增高的趋势，流式细胞术检测各处理组细胞的凋亡状况进一步显现，polβ基因缄默沉静添加了食管癌细胞株的放射医治灵敏性，这在必定程度上添加了对polβ基因在DNA修正中效果的规则和机制的知道，也预示了RNA搅扰技能在未来食管癌及其他肿瘤的基因医治方面将具有重要的运用价值。
[参阅文献]
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（收稿日期：2014-06-18 本文修改：林利利）
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（收稿日期：2014-06-18 本文修改：林利利）
