钟祥龙 张强 赵越 姜涛
[摘要] 意图 评论醋酸阿托西班的固相组成工艺及纯化办法，以得到高纯度醋酸阿托西班。办法 选用Fmoc氨基酸为质料，选用固相组成办法，以Rink-AM树脂为载体，TBTU/HOBt为缩合剂催化组成直链肽，以碘/乙醇液为氧化剂，选用固相环化，两个游离单巯基的氧化生成二硫键而得到方针环肽，体积份额为95/2.5/2.5裂解液TFA/EDT/Water裂解，制得阿托西班粗品，液相剖析粗品的纯度为86.24%，制备反相高效液相色谱法纯化，制得醋酸阿托西班，纯度>98%。 成果 组成醋酸阿托西班粗品，经制备反相高效液相色谱纯化，纯度>98%。 定论 该办法简略，组本钱钱低，纯度高，可用于工业化出产。
[要害词] 阿托西班；固相组成；HPLC；纯化；工艺研讨
[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（b）-0017-05
醋酸阿托西班注射液是由Ferring GmbH研发的一种新的抗早产药，为欧洲医药学会引荐的一线用药，是一种缩宫素的竞争性抑制剂，经过结合在子宫肌层和蜕膜的缩宫素受体上，阻挠缩宫素在靶细胞上发挥作用，然后到达防备早产的作用[1-3]。
阿托西班是一条由9个氨基酸组成的二硫键型的环肽多肽，是1，2，4和8位润饰的缩宫素分子，肽的N端为3-巯基丙酸（巯基与[Cys]6的巯基构成二硫键），C端为酰胺的方式。N端第二个氨基酸是乙基化润饰的[D-Tyr（Et）]2。阿托西班在药品中以醋酸盐的方式存在，通用名为醋酸阿托西班，肽序如下：
现在国内外专利或文献[4-6]所报导的大多数是经过固相化学组成办法来得到阿托西班，所以本研讨选用Fmoc/tbu战略的固相化学组成道路，用逐渐缩合的战略成功组成了九肽的阿托西班。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Synthware固相组成反响柱（北京欣维尔）；JJ1000型精细电子天平（常熟双杰测验仪器厂）；SHZ-Ⅲ循环水真空泵（巩义予华仪器有限公司）；DZF-6020真空枯燥箱（上海申贤恒温设备厂）；液相剖析仪器（岛津LC-10Avp）；液相剖析色谱柱（岛津VP-ODS，4.6×150 mm）；JBR-1型多肽组成仪（海南建邦）。
1.2 试剂
Rink AM树脂（批号：GRMK0305，代替度：0.32 mmol/g，天津南开和成科技有限公司）；Rink AM树脂（批号：GRML0101，代替度：0.93 mmol/g，天津南开和成科技有限公司），Fmoc维护的氨基由上海吉尔生化科技有限公司供给，包含：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Orn（Boc）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Tyr（Et）-OH、Mpa（Trt）-OH；缩合剂TBTU/HOBt由姑苏中科天马肽工程中心有限公司供给；市售阿托西班进口制剂对照品（批号：AC0089G，出产厂家：Ferring GmbH）；哌啶、吡啶、三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、苯甲硫醚（thioanisole）、苯酚（phenol）、乙二硫醇（EDT）、N，N-二异丙基乙胺（DIEA）、醋酸酐（AC2，O）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、冰乙醚和二氯甲烷（DCM）、二甲基亚砜（DMSO）和过氧化氢溶液（H2O2）均为剖析纯；乙腈（色谱纯，天津科密欧试剂有限公司），超纯水为试验室克己。
2 办法与成果
2.1 阿托西班组成办法探索
2.1.1 树脂类型的挑选 由于阿托西班羧基端是肽酰胺的方式，常用有两种办法能够得到：①用2-氯三苯甲基氯树脂先拼装肽链后，挑选性切开满足维护的肽片段，然后在液相中将肽羧酸酰胺化，再脱除侧链维护基得到方针肽；②直接从氨基类树脂开端组成后，切开即得到意图肽酰胺。现在，氨基类树脂已完结工业化出产和供给，本研讨挑选进程较少的办法②——选用Rink AM树脂作为固相组成的开端树脂[7-8]。
2.1.2 树脂的代替度挑选 一般树脂的代替度凹凸挑选是依据肽链的长短来挑选适合的规模，阿托西班为九肽化合物，相对肽链较短。市售的Rink AM树脂代替度一般在0.3～0.9 mmol/g，据此挑选低、高水平两种规范的Rink AM树脂（0.32 mmol/g，批号：GRMK0305；0.93 mmol/g，批号：GRML0101），按惯例逐渐偶联得到阿托西班肽树脂，再裂解得到阿托西班线形肽来进行比照试验，以肽树脂增重率、线型肽收率为调查规范，点评代替度水平凹凸对反响的影响（表1）。
由表1成果可见，0.32、0.93 mmol/g两种凹凸代替度规范的Rink AM树脂的组成成果在肽树脂增重率、线型肽收率方面有显着不同。因而，选用低代替度的Rink AM作为阿托西班固相组成的树脂载体。
2.2 氨基酸投料比的挑选
文献中[4]报导的多为2～5倍的投料量，本试验规划了氨基酸投料比分别为2.0、3.0、4.0、5.0 eq. 4个水平的平行试验，条件见表2。经过逐渐偶联得到阿托西班肽树脂，再裂解得到阿托西班线形肽，调查肽树脂增重率、固体线性肽收率及粗肽纯度等方针，来断定最优的投料比（表3）。
由表3成果可见，2.0、3.0倍氨基酸投料比，肽树脂增重率，线型肽收率及粗肽纯度均较低，而4.0、5.0倍氨基酸投料成果无显着差异且较高，结组本钱要素，本研讨挑选4.0倍的氨基酸投料比。
2.3 激活剂的挑选
多肽组成中的激活剂大多数是经过活化羧基完结肽键缩合反响，现在可用于肽键缩合的试剂和缩合办法较多，常见的有酰基叠氮物法、酸酐法、碳二亚胺法、活化酯法、磷鎓盐试剂法、脲鎓盐试剂法等[9-10]。这些缩合办法及缩合试剂均具有各自的特色，综组本钱、激活功率、安全要素等考虑，本研讨选用TBTU/HOBt组合来作为首要的激活剂。
2.4 温度和反响时刻的断定
多肽缩合反响为较温文的化学反响，对温度要求并不严苛，一般的洁净区的18～26℃温度规模内均是较适合的反响温度；在此温度规模内，每个氨基酸偶联的时刻能够经过经典的游离氨基检测办法——茚三酮（Kaiser test）查验法来断定偶联反响结尾，此办法的活络度及精确度现已得到研讨者共同认可[11]。
2.5 裂解进程捕获剂的挑选
肽链拼装结束后需求用强酸[Fmoc/tBu化学一般选用三氟乙酸（TFA）作为酸切开剂]将肽链从树脂上释放出来，在切开肽的一起侧链维护基团也会被相应的脱除，这时需求捕获剂来捕获侧链维护基团构成的正碳离子等活性离子，以防止其再次与多肽氨基酸残基的活性侧链基团结合生成副产品，依据Fmoc/tbu战略挑选的氨基酸侧链维护基团首要有三苯甲基（Trt）、叔丁基（tBu）、叔丁氧羰基（Boc）3种，依据文献报导[9]，常用乙二硫醇和水作为捕获剂，因而挑选EDT和水作为捕获剂。
裂解液的组成为TFA/EDT/Water=95/2.5/2.5（v/v）。
2.6 环化办法挑选
阿托西班结构中含有一对二硫键，其构成是经过两个游离单巯基的氧化得到。氧化办法按载体分首要有固相环化法与液相环化法[7，12-13]两种。环化办法需求挑选的条件包含氧化剂、环化浓度、pH等。
本试验规划了用碘作为氧化剂的固相环化和液相环化两种办法，其间液相环化又规划了线型肽溶解浓度分别为0.5、1、5 mmol/L 3个水平的平行环化试验，所运用的肽树脂组成办法拜见表4，环化试验条件拜见表5，经过比较环化粗肽纯度来挑选最佳的办法或浓度。
首先按表4的组成条件完结肽树脂的偶联，再按表5环化条件进行固相或液相环化。液相环化反响的作用和反响结尾，能够用HPLC来监测，固相环化的环化作用则需选用先取样裂解后再经过HPLC检测的办法，HPLC剖析色谱条件拜见“2.3”项下，试验成果见表6。
由表6可见，固相环化和低肽浓度液相环化的纯度都比较高，考虑到操作便利，本研讨选用固相环化的办法，氧化剂为碘/乙醇液。
2.7 阿托西班组成办法的进程
2.7.1 Fmoc-Gly-rink-AM resin 树脂的制备 以0.32 mmol/g Rink AM为载体，用DMF溶胀30 min，抽去；DMF洗刷树脂2次，每次2～5 min。
2.7.2 Atosiban -rink-AM resin 树脂的制备 参加20%PIPE/DMF脱Fmoc维护15 min；去Fmoc维护后洗刷，用DMF洗刷树脂3次抽干，每次2～5 min，茚三酮检测显蓝黑色；制造氨基酸偶联液，以4倍的氨基酸投料比，称取Fmoc-Gly-OH和HOBt，参加DMF混合溶解弄清，缓慢参加TBTU，混匀后参加到盛有树脂的反响器中，开端偶联反响；反响2 h后，取少数树脂洗刷后，茚三酮监测反响结尾，当树脂及溶液不显色，标明反响彻底；偶联结束后，DMF洗刷1次，2～5 min。依照阿托西班氨基酸序列自C端向N端顺次在树脂上偶联，直到最终Mpa偶联结束，参加20%PIPE/DMF脱Fmoc维护15 min；DMF洗刷3次，每次2～5 min，DCM洗刷3次，每次2～5 min，抽干树脂；树脂抽真空30℃以下枯燥[7，14]。
2.7.3 线型肽树脂环化 环化：线型肽树脂中参加5%醋酸水溶液，制造碘/乙醇溶液，滴加至上述肽溶液中，1 h后，HPLC监测环化结尾，氧化结束得到Atosiban-rink-AM resin。
2.7.4 Atosiban-rink-AM resin 树脂的裂解 制造体积份额为95/2.5/2.5裂解液TFA/EDT/Water，数量为15 ml/g肽树脂，冰浴下参加到枯燥的树脂中，参加结束后升温至室温反响150 min，过滤树脂，用TFA少数洗刷树脂，兼并滤液，浓缩除掉大部分三氟醋酸后，倾入冷的乙醚中分出沉积，离心搜集沉积，用冷乙醚洗刷沉积3次，真空枯燥[15-16]，得Atosiban粗品；收率为106.89%。经过液相剖析得到环肽粗品的纯度为86.24%。
2.8 醋酸阿托西班粗品纯化
2.8.1 阿托西班粗品溶液成分判定剖析 对阿托西班粗品水溶液进行剖析（图1），色谱条件详细如下。活动相A：0.1%TFA水溶液；活动相B：乙腈，B相30%～45%，梯度洗脱30 min；紫外检测波长：215 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：室温[17-18]。再用市售制剂醋酸阿托西班注射液（批号：AC0089G）作为对照品以断定样品的出峰方位，得到色谱图（图2）。经过与样品色谱图比较，证明粗品液中保存时刻为12.8 min峰为方针产品。
2.8.2 阿托西班粗品水溶液的纯化制备 将约含2 g阿托西班的粗品水溶液，用制备反相高效液相别离纯化，制备柱Novasep，色谱条件详细如下。活动相A：0.1%TFA水溶液；活动相B：乙腈，B相24%～34%，梯度洗脱60 min；紫外检测波长：230 nm；流速：70.0 ml/min；柱温：室温。分段搜集方针峰，经高效液相检测兼并组分，最终得到主峰纯度>98%的组分。
3 评论
多肽的固相组成是一个重复增加氨基酸的进程，固相组成次序一般从羧基端（C端）向氨基端（N端）组成。固相组成法尽管减轻了每步产品提纯难度，但无法纯化中间体，终产品有必要纯化[19]。
本研讨对Fmoc/tbu的固相组成道路首要要害参数进行探索和工艺条件断定，探索的要害参数包含树脂类型、树脂代替度、氨基酸投料比、激活剂品种、反响温度与反响时刻、环化办法以及捕获剂品种。选用的低代替度Rink AM树脂作为固相组成的开端树脂，进程较少，易完结工业化出产和供给。4.0倍的氨基酸投料比，纯度及产率高，选用TBTU/HOBt组合来作为首要的激活剂，安全有用。茚三酮查验法来断定偶联反响结尾，办法活络及精确，碘/乙醇固相环化办法，得到粗品纯度高。经制备型高效液相纯化后，纯度达98%以上，总收率高，可为工业化出产供给学习。
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（收稿日期：2014-05-23 本文修改：林利利）
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（收稿日期：2014-05-23 本文修改：林利利）
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（收稿日期：2014-05-23 本文修改：林利利）
