王敏++++++朴金松++++++高蔚樱++++++郑一玮++++++谭小军
[摘要] 意图 评论肝细胞癌肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）β-catenin的表达与HCC临床病理特征的联络。办法 使用Envsion法检测333例HCC，168例癌旁肝安排及89例正常肝安排的β-catenin表达；RT-PCR检测37例HCC及癌旁安排，肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株LO2的β-catenin mRNA表达。成果 β-catenin在HCC胞质、胞核的阳性表达率为79%/37%；在癌旁和正常肝安排中的表达率为72%/0%、70%/0%。差异均有统计学含义（P均<0.05）。且分解好的癌细胞表达低，分解差的细胞表达高。一起，HCC和HepG2的β-catenin mRNA表达高于癌旁安排及LO2的表达。定论 肝细胞癌的β-catenin过表达提示其在癌的发作进程中可能起着促癌的效果。
[要害词] β-catenin；肝细胞癌；安排芯片；免疫安排化学；RT-PCR
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）13-0031-04
Wnt/β-catenin信号途径调理操控着许多生命进程，包含生物体的成长、发育、疾病、变老与逝世等。一起，Wnt/β-catenin信号途径也与肿瘤的发作密切相关，有十几种现在已知的高发性癌变源于Wnt/β-catenin信号转导途径的失调[1]。β-catenin是Wnt信号途径中具转录调控活性的要害成员，β-catenin能在细胞核内与Wnt途径的另一类成员LEF1/TCFs 结合然后激活靶基因的转录。β-catenin在正常成体细胞胞浆内含量少，而在肿瘤中常呈现胞浆内累积和核内表达。因而，本研讨拟通过检测β-catenin在大样本肝细胞癌病例中的表达，并对其阳性表达与肝细胞癌的临床病理特征进行剖析，评论其在肝细胞癌发作和开展中的效果，以期进一步阐明肝细胞癌的发病机制。
1 材料与办法
1.1 材料
白腊标本：搜集广州医科大学隶属肿瘤医院病理科1998年1月～2008年1月清晰确诊的肝细胞癌标本333例、癌旁肝安排168例及正常肝安排89例。每例患者均挂号临床病理材料，包含年纪、性别、癌灶巨细、HBs-Ag 状况、有无门静脉癌栓构成、血清AFP水平，肿瘤分级状况、TMN分期。
安排标本与细胞株：搜集广州医科大学隶属肿瘤医院2010年～2011年外科手术切除的新鲜肝细胞癌安排及其对应的癌旁非肿瘤安排共37例，其中男32例，女5例，年纪25～73岁，均匀50.1岁。肝细胞癌细胞株HepG2，肝正常细胞株LO2均为广州医科大学肿瘤研讨所保存。
1.2 首要试剂
β-catenin抗体（鼠抗人单克隆抗体，美国Transduction laboratories，clone 14），EnvisionTM试剂盒（K5007）购自DAKO公司；TRIzol Reagent（美国invitrogen），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（美国MBI）。
1.3 办法
选用免疫组化Envision法及RT-PCR法进行检测，详细试验进程参照试剂盒阐明进行。
1.4 成果判别
染色成果判别：β-catenin阳性染色部位为胞膜、胞质和胞核。评分标准选用归纳阳性细胞所占百分比和上色强度进行判别[2]。阳性细胞上色程度按轻、中及重度染色别离计为1、2、3分。阳性细胞所占百分比积分如下：0分为阳性细胞份额<5%，1分为6%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为>76%。然后依据两项评分乘积判别成果。
RNA成果剖析：选用图画剖析软件Gensnap对电泳成果进行半定量剖析，核算意图基因和内参基因的灰度比值。
1.5 统计学剖析
一切数据均选用SPSS 15.0统计学软件包进行处理。选用χ2查验或Fisher准确查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 β-catenin蛋白的表达
β-catenin蛋白在胞膜的阳性表达率是70%（234/333）；在癌旁和正常肝安排的表达率别离是60%（100/168）和65%（58/89）。β-catenin在非癌安排中的膜表达低于在癌安排中的膜表达（封三图4A、C、D）。经统计学剖析，肝细胞癌中β-catenin膜的表达与在非肿瘤安排中膜的表达两两比较有明显性差异（癌旁，P=0.000；正常肝安排，P=0.000）； β-catenin胞质的阳性表达率是79%（262/333）；在癌旁和正常肝安排中的表达率别离是72%（122/168）和70%（62/89）。β-catenin在非癌安排中的胞质表达低于在癌安排中的表达（封三图4A、C、D）。经统计学剖析，肝细胞癌中β-catenin胞质的表达与在非肿瘤安排中胞质的表达两两比较有明显性差异（癌旁，P=0.000； 正常肝安排，P=0.000）； β-catenin蛋白在胞核的阳性表达率是37%（123/333），在非癌安排中无核表达（封三图4B）。经统计学剖析，肝细胞癌中β-catenin胞核表达与在非肿瘤安排中核表达两两比较有明显性差异（癌旁，P=0.000； 正常肝安排，P=0.000）。
2.2 β-catenin mRNA的表达
本试验检测了37例肝细胞癌及对应的癌旁非肿瘤安排中β-catenin mRNA的表达。β-catenin mRNA在癌旁非肿瘤安排的表达显着低于其在肝细胞癌安排中的表达（图1）。经统计学剖析，β-catenin mRNA在肝细胞癌安排和癌旁非肿瘤安排中的表达量有明显性差异（P=0.001）。本试验也检测了β-catenin mRNA在肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株LO2的表达。β-catenin mRNA在HepG2的表达显着高于其在LO2的表达（图1）。
A：肝细胞癌（T）及对应的癌旁非肿瘤安排（P）中β-catenin mRNA的表达；B：1.正常肝细胞株LO2中未检测出β-catenin mRNA的表达；2.肝细胞癌细胞株HepG2中β-catenin mRNA 过表达
图1 β-catenin mRNA的表达
2.3 β-catenin蛋白的表达与肝细胞癌临床病理参数的联络
β-catenin胞质表达与肿瘤细胞分解密切相关（P=0.031），跟着细胞的分解程度下降而添加。与年纪、性别、AFP值、肿瘤巨细、HBs-Ag 感染、门静脉癌栓和TNM分期无统计学含义。β-catenin蛋白核表达与HBV 感染密切相关（强度，P=0.028；百分比，P=0.026），与细胞分解程度相关（P=0.023），β-catenin蛋白核表达跟着细胞分解程度的下降而添加。与年纪、性别、AFP值、肿瘤巨细、门静脉癌栓和TNM分期比较，差异无统计学含义（表1）。
3 评论
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率区域差异很大，常见于亚洲和非洲国家。HCC的发作是一个多阶段、多要素协同效果，通过发动、促癌和演进等多进程进程以及多个癌基因和相关基因参加、多个基因发作骤变的成果。有研讨显现，β-catenin基因外显子3骤变在肝癌中是频发事情，可达62.5%，其骤变可使β-catenin安稳化，促进肝癌的发作[3]。
正常状况下β-catenin首要与细胞膜上E-cadherin结合参加细胞黏附效果，细胞内的β-catenin与糖原合成酶激酶3（GSK-3），结直肠腺瘤息肉蛋白（APC）和轴蛋白（Axin）结合，构成多聚蛋白复合体。并在APC和GSK-3β等效果下很快降解，不会构成集合。当Wnt蛋白与胞膜受体结合后按捺GSK-3激活，阻挠β-catenin多聚蛋白复合体的构成，β-catenin降解削减然后进入细胞核内构成β-catenin-Tcf/Lef复合体，调控下流靶基因的表达，参加肿瘤的发作开展。如乳腺癌、食管癌、结直肠癌、恶性黑色素瘤、白血病、前列腺癌、子宫内膜癌、原发性肝癌、甲状腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤中都有Wnt/β-catenin通路反常[4]。
Lai等[5]研讨成果显现β-catenin mRNA在肝细胞癌中的表达显着高于癌旁肝安排，免疫组化成果亦显现β-catenin反常累积呈现在肝细胞癌细胞胞核中； Austinat等[6]的研讨显现，在53例肝细胞癌标本中有42例呈胞质/胞核阳性表达；Inagawa的研讨亦标明[7]β-catenin 在肝癌中呈部分或广泛核内表达，其核阳性表达率达35.3%，在癌旁非肿瘤安排中无胞核表达。Higgs MR等[8]的研讨显现HCV型肝炎病毒诱导活化的β-catenin促进c-Myc基因的表达，标明β-catenin与HCV相关肝细胞癌的发作开展中起着重要的效果。Evason KJ等[9]研讨发现β-catenin在非典型肝细胞腺瘤样肿瘤与高分解肝细胞癌中的激活都有类似的形态学和细胞遗传学的改动，提示β-catenin在肝细胞癌发作的前期发作改动。本试验成果显现，β-catenin在癌旁肝安排和正常肝安排中中首要集合在肝细胞膜，在大样本肝细胞癌安排中β-catenin胞质/核表达显着升高，核表达阳性率为37%。RT-PCR成果显现β-catenin mRNA在癌安排表达高，在非肿瘤安排中表达低；在肝癌细胞株HepG2表达高，在正常肝细胞株LO2表达低。与王启明等[10]的研讨成果共同，亦提示β-catenin的激活与肝细胞癌的发作开展密切联络。
HCC的很多临床病理参数都与其生物学行为或预后存在着必定的联络。徐兵等[11]研讨发现，β-catenin的异位表达与肿瘤的分级密切相关。本研讨成果显现，β-catenin胞质/核的表达与肿瘤细胞分解程度和HBs-Ag状况（status）明显相关；β-catenin在分解差的细胞质/核表达高，分解好的细胞质/核表达低。β-catenin作为Wnt/β-catenin通路的要害成员，对细胞的分解有重要影响。Witjes CD等[12]研讨标明β-catenin蛋白在胞质和核内的积累与肝细胞癌细胞分解相关，低分解细胞表达升高，高分解细胞中减低。因而，本研讨成果提示β-catenin蛋白的反常积累进程伴跟着细胞分解程度的下降，参加了肝细胞癌的发作开展。
[参考文献]
[1] Surana R，Sikka S，Cai W，et al. Secreted frizzled related proteins： Implications in cancers[J]. Biochim Biophys Acta，2013，1845（1）：53-65.
[2] Chengquan Z，Ross B，Russell V，et al. Diagnostic utility of WT1 immunostaining in ovarian sertoli cell tumor[J]. Am J Surg Pathol，2007，31：1378-1384.
[3] Lachenmayer A，Alsinet C，Savic R，et al. Wnt-pathway activation in two molecular classes of hepatocellular carcinoma and experimental modulation by sorafenib[J]. Clin Cancer Res，2012，18（18）：4997-5007.
[4] Klaus A，Birchmeier W. Wnt signalling and its impact on development and cancer[J]. Nat Rev Cancer，2008，8（5）：387-398.
[5] Lai TY，Su CC，Kuo WW，et al. β-catenin plays a key role in metastasis of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2011，26（2）：415-422.
[6] Austinat M，Dunsch R，Gaunitz F，et al. Correlation between beta-catenin mutations and expression of Wnt-signaling target genes in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer，2008，7（21）：1-9.
[7] Inagawa S，Itabashi M，Fukao K，et al. Expression and prognostic roles of β-catenin in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2002，8（2）：450-456.
[8] Higgs MR，Lerat H，Pawlotsky JM. Hepatitis C virus-induced activation of β-catenin promotes c-Myc expression and a cascade of pro-carcinogenetic events[J]. Oncogene，2013，32（39）：4683-4693.
[9] Evason KJ，Grenert JP，Ferrell LD， et al. Atypical hepatocellular adenoma-like neoplasms with β-catenin activation show cytogenetic alterations similar to well-differentiated hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol，2013，44（5）：750-758.
[10] 王启明，贾连群，周鸿鹰，等. Wnt/β-catenin 信号因子在HepG2以及LO2细胞中的表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2007，32（8）：826-829.
[11] 徐兵，罗庆丰，江凌玲，等. 肝细胞肝癌β-catenin的表达与临床病理特征的联络[J].江西医药，2011，46（12）：1072-1074.
[12] Witjes CD， Ten Kate FJ， Verhoef C， et al. Immunohis to chemical characteristics of hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic livers[J]. J Clin Pathol，2013，66（8）：687-691.
（收稿日期：2013-11-06）
[5] Lai TY，Su CC，Kuo WW，et al. β-catenin plays a key role in metastasis of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2011，26（2）：415-422.
[6] Austinat M，Dunsch R，Gaunitz F，et al. Correlation between beta-catenin mutations and expression of Wnt-signaling target genes in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer，2008，7（21）：1-9.
[7] Inagawa S，Itabashi M，Fukao K，et al. Expression and prognostic roles of β-catenin in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2002，8（2）：450-456.
[8] Higgs MR，Lerat H，Pawlotsky JM. Hepatitis C virus-induced activation of β-catenin promotes c-Myc expression and a cascade of pro-carcinogenetic events[J]. Oncogene，2013，32（39）：4683-4693.
[9] Evason KJ，Grenert JP，Ferrell LD， et al. Atypical hepatocellular adenoma-like neoplasms with β-catenin activation show cytogenetic alterations similar to well-differentiated hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol，2013，44（5）：750-758.
[10] 王启明，贾连群，周鸿鹰，等. Wnt/β-catenin 信号因子在HepG2以及LO2细胞中的表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2007，32（8）：826-829.
[11] 徐兵，罗庆丰，江凌玲，等. 肝细胞肝癌β-catenin的表达与临床病理特征的联络[J].江西医药，2011，46（12）：1072-1074.
[12] Witjes CD， Ten Kate FJ， Verhoef C， et al. Immunohis to chemical characteristics of hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic livers[J]. J Clin Pathol，2013，66（8）：687-691.
（收稿日期：2013-11-06）
[5] Lai TY，Su CC，Kuo WW，et al. β-catenin plays a key role in metastasis of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2011，26（2）：415-422.
[6] Austinat M，Dunsch R，Gaunitz F，et al. Correlation between beta-catenin mutations and expression of Wnt-signaling target genes in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer，2008，7（21）：1-9.
[7] Inagawa S，Itabashi M，Fukao K，et al. Expression and prognostic roles of β-catenin in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2002，8（2）：450-456.
[8] Higgs MR，Lerat H，Pawlotsky JM. Hepatitis C virus-induced activation of β-catenin promotes c-Myc expression and a cascade of pro-carcinogenetic events[J]. Oncogene，2013，32（39）：4683-4693.
[9] Evason KJ，Grenert JP，Ferrell LD， et al. Atypical hepatocellular adenoma-like neoplasms with β-catenin activation show cytogenetic alterations similar to well-differentiated hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol，2013，44（5）：750-758.
[10] 王启明，贾连群，周鸿鹰，等. Wnt/β-catenin 信号因子在HepG2以及LO2细胞中的表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2007，32（8）：826-829.
[11] 徐兵，罗庆丰，江凌玲，等. 肝细胞肝癌β-catenin的表达与临床病理特征的联络[J].江西医药，2011，46（12）：1072-1074.
[12] Witjes CD， Ten Kate FJ， Verhoef C， et al. Immunohis to chemical characteristics of hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic livers[J]. J Clin Pathol，2013，66（8）：687-691.
（收稿日期：2013-11-06）
