赵晓辉++++++韩子强
[摘要] 意图 了解人附红细胞体感染对小鼠白细胞凋亡的影响。办法 用流式细胞仪对白细胞凋亡以及CD4+ 和CD8+ T 淋巴细胞亚群的动态改变规则进行检测。成果 感染后CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞份额下降，CD4+ T 淋巴细胞份额在感染后第3天和第5天资别由感染前的12.89% 下降到10.83% 和6.34%，CD8+ T 淋巴细胞份额由感染前的8.31% 别离下降到6.16%和4.32%。白细胞凋亡的检测显现， 感染初期感染组凋亡细胞明显高于对照组。定论 人附红细胞体诱导细胞凋亡是导致免疫按捺和免疫细胞削减的首要原因。
[关键词] 人附红细胞体；小鼠； 白细胞； 细胞凋亡
[中图分类号] R725；S858.28 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）13-0007-03
附红细胞体（Eperythrozoon）是寄生于红细胞外表、血浆及骨髓中的一群微生物，能导致人和动物的附红细胞体病（Eperythrozoonosis）。自1928年Schilling和Dinger 等别离在啮齿类动物中查到该病原体后，迄今全世界已有30多个国家和区域对此报导。近几年，学者首要对附红细胞体所寄生的红细胞及红细胞免疫学方面研讨较多[1]，而未发现有关人附红细胞体对白细胞影响改变的报导。为了解人附红细胞体感染后宿主机体免疫状况的改变，本实验对人附红细胞体感染小鼠后外周血白细胞改变、白细胞凋亡的改变及CD4+和CD8+T 淋巴细胞亚群改变进行检测，为进一步研讨人附红细胞体感染人群附红细胞体病供给理论基础。
1 材料与办法
1.1 实验动物和首要试剂
SPF级BALB/c小鼠，购自泰山医学院实验动物中心，共36只，男女参半，6～8周龄，体重22～24 g。人附红细胞体阳性血液经过医院确诊的人附红细胞体感染阳性的患者采纳；从美国罗氏公司购买的ACTGene Annex in V-FITC细胞凋亡试剂盒；从美国BD公司购买的用荧光符号的CD3+、CD4+和CD8+单克隆抗体。
1.2 样品收集
将36只小鼠随机分为实验组和对照组，每组18只，阻隔养殖。实验组经腹腔接种附红细胞体悬液0.5 mL/只，对照组经腹腔接种生理盐水0.5 mL/只，别离于感染第1、3、5、7、9天经心脏取血，肝素抗凝。
1.3 外周血白细胞及白细胞凋亡检测
收集的抗凝血用BC-2000血液细胞剖析仪检测白细胞总数量。依据细胞凋亡试剂盒说明书运用程序，用Annex in V-FITC和PI双试剂对白细胞进行染色，经过流式细胞仪双通道检测荧光信号[2]。
1.4 CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群检测
依照检测试剂和仪器说明书，运用流式细胞术检测。取肝素抗凝血样本100 μL别离参加CD3+、CD4+和CD3+、CD8+单克隆抗体对照10 μL，室温避光孵育30 min，参加溶血素溶解红细胞后，1500转/min，离心5 min， 弃上清，用PBS 从头悬浮细胞，过滤网过滤样本后上机检测[3-4]。
1.5 统计学办法
运用SPSS13.0软件包进行统计剖析，计量材料以（x±s）表明，组间比较选用t查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 白细胞总数的改变
感染后实验组小鼠外周白细胞总数量明显削减，白细胞总数量平均值由感染前的4.95×109/L，下降到感染后第5天的3.27×109/L，与感染前比较差异明显（P<0.05）。感染后第9天削减至2.89×109/L，仅为感染前的白细胞总数的58.4%，与感染前比较，差异明显（图1）。对照组白细胞总数在实验前后没有明显改变。
图1 人附红细胞体感染小鼠白细胞总数的改变
2.2 白细胞凋亡的改变
对实验组和对照组小鼠白细胞进行凋亡检测，实验组在感染后第3天和第5天，小鼠白细胞凋亡的份额明显高于对照组，特别是在第5天，实验组小鼠白细胞凋亡数占细胞总数平均值8.17%，对照组小鼠白细胞凋亡数平均值1.2%，差异有统计学含义（P<0.05）。在第7、9天，实验组与对照组白细胞调亡数白细胞总数比较不明显。
2.3 CD4+、CD8+ T淋巴细胞的改变
别离在感染后第3、5、7、9天收集外周血，检测小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞的改变。成果是感染前实验组小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞数占T淋巴细胞总数的百分比别离为12.89%和8.31%，感染后百分比逐步下降。在第3天，CD4+、CD8+ T淋巴细胞明显削减，别离下降到10.83%和6.16%；感染后第5天，别离为6.34%和4.32%。但在感染后第7天，CD4+、CD8+ T淋巴细胞份额上升，到第9天，别离为6.54%和4.78%（图2）。
图2 人附红细胞体感染小鼠CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的改变
3 评论
附红细胞体病是一种新式人兽共患性疾病，动物方面的盛行报导及相关研讨居多，而关于人附红细胞体的感染报导及研讨较少。据王柯棣[5]等报导人附红细胞体在全国广泛盛行，包含不同地域的城市和乡村都有报导[6-7]。不同地域的感染率都不同，有的当地人群的感染率达到了40%以上，应引起当地部分注重。相对人附红细胞体病的探究也仅仅在确诊方法、临床医治药物等运用性临床研讨。关于在附红细胞体病的分类、不同宿主附红细胞体的感染途径及生物学特征以及对机体免疫系统的影响等方面还没有清晰的报导[8]。本实验在前期的研讨基础上，对人附红细胞体感染小鼠白细胞研讨具有重要参阅含义。
经过实验，咱们发现人附红细胞体感染小鼠引起外周白细胞数量削减，与大部分细菌感染机体后，导致炎症发作，引起白细胞增多状况不同。依据盛行病学查询，人群中附红细胞体感染大多不体现临床症状，没有炎症的发作，只要在免疫力下降或许患缓慢耗费性疾病时，才发作感染发病[9]，具有时机致病菌的的特色。因为该微生物附在红细胞上或许游离在血液中，学者们对红细胞体免疫研讨较多，而对附红细胞体与白细胞联系研讨很少，因此人附红细胞体感染导致白细胞削减与感染疾病的相关性还需要进一步研讨。
本次咱们选用流式细胞仪剖析在人附红细胞体感染后，小鼠外周CD4+、CD8+ T淋巴细胞和白细胞凋亡改变，初次描绘了人附红细胞体感染后外周血免疫细胞的消长改变状况。本实验运用Annexin-V-FITC-PI 双标法，能很好分隔活细胞、坏死细胞及凋亡细胞。本实验成果显现，白细胞凋亡在人附红细胞体感染后前5天，凋亡份额逐步添加，而在第7、9天凋亡数与对照组相比较差异并不明显。白细胞凋亡进程是生化改变、基因调控、细胞信号转导及酶激活等多方面效果的成果， 受多因子调理， 其机制现在还不太清楚。迄今为止，人附红细胞体感染导致外周白细胞凋亡研讨未见报导，是否与其诱导或按捺原癌基因bc1-2及其相关基因有关，还需要进一步研讨。杨朋艳等[10]报导，猪附红细胞体感染小鼠后淋巴细胞总数明显削减，另据杨蕾芳等[11]报导TH17细胞可能在附红细胞体染进程中发挥了必定的免疫调理，而赵里等[12]报导树突状细胞可能发挥了负性调理效果。本实验测定人红细胞体感染后，CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群明显削减，由此可推断人附红细胞体感染诱导的白细胞及T淋巴细胞削减可能导致感染初期机体的免疫按捺，然后为人附红细胞体感染机体的免疫学研讨供给数据。
[参阅文献]
[1] 李国兰，杨玉芝，郭岭，等. 附红细胞体研讨发展[J]. 我国病原生物学杂志，2008，3（8）：629-630.
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[3] 郑敏，熊娟，赵骥. 大蒜多糖C对正常小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响[J]. 咸宁学院学报（医学版），2007，21（1）：9-12.
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[5] 王柯棣，王章云. 附红细胞体病研讨发展[J]. 教育教育论坛，2012，37：29-31.
[6] 文海蓉，熊丽，吴景文，等. 南昌区域人体附红细胞体盛行病学查询[J]. 现代防备医学，2012，39（17）：4361-4362.
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[8] 司唯，姚琳，贾立军，等. 猪附红细胞体感染途径研讨[J]. 动物医学发展，2012，33（12）：85-87.
[9] 尚德秋，陆光宇. 附红细胞体感染人畜的盛行病学查询（Ⅲ）[J]. 中华盛行病学杂志，1997，17（3）：150-152.
[10] 杨朋艳，梁晚枫，张守发. 猪附红细胞体感染BALB/c小鼠实验研讨[J]. 我国农学通报，2012，28（23）：69-72.
[11] 杨蕾芳，巴彩凤. 流式细胞术检测小鼠感染附红细胞体后TH17细胞的表达[J]. 我国人兽共患病学报，2012， 28（4）：347-350.
[12] 赵里，单思，巴彩凤. 猪附红细胞体对树突状细胞老练的影响研讨[J]. 我国农学通，2013，29（32）：58-62.
（收稿日期：2014-02-25）
本次咱们选用流式细胞仪剖析在人附红细胞体感染后，小鼠外周CD4+、CD8+ T淋巴细胞和白细胞凋亡改变，初次描绘了人附红细胞体感染后外周血免疫细胞的消长改变状况。本实验运用Annexin-V-FITC-PI 双标法，能很好分隔活细胞、坏死细胞及凋亡细胞。本实验成果显现，白细胞凋亡在人附红细胞体感染后前5天，凋亡份额逐步添加，而在第7、9天凋亡数与对照组相比较差异并不明显。白细胞凋亡进程是生化改变、基因调控、细胞信号转导及酶激活等多方面效果的成果， 受多因子调理， 其机制现在还不太清楚。迄今为止，人附红细胞体感染导致外周白细胞凋亡研讨未见报导，是否与其诱导或按捺原癌基因bc1-2及其相关基因有关，还需要进一步研讨。杨朋艳等[10]报导，猪附红细胞体感染小鼠后淋巴细胞总数明显削减，另据杨蕾芳等[11]报导TH17细胞可能在附红细胞体染进程中发挥了必定的免疫调理，而赵里等[12]报导树突状细胞可能发挥了负性调理效果。本实验测定人红细胞体感染后，CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群明显削减，由此可推断人附红细胞体感染诱导的白细胞及T淋巴细胞削减可能导致感染初期机体的免疫按捺，然后为人附红细胞体感染机体的免疫学研讨供给数据。
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（收稿日期：2014-02-25）
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（收稿日期：2014-02-25）
