甘露 邓之婧 王献哲 苏棋 梁聪 郭哲 何萍
[摘要]意图 探討二氢杨梅素（DMY）对小鼠局灶性脑缺血再灌注（I/R）损害的抗细胞凋亡效果和相关机制，然后研讨DMY抗脑缺血损害的维护机制。办法 将雄性昆明种小鼠随机分为假手术组、I/R模型组及DMY（500 mg/kg）组。小鼠大脑中动脉堵塞/再灌注（MCAO/R）局灶性脑I/R损害模型使用改进线栓法来进行制备与完善。DMY组术前接连灌胃给药10 d，每天1次，并在缺血前1 h及再灌注后12 h各给药1次。缺血3 h再灌注24 h后，取脑选用原位缺口末端标记法（TUNEL）进行凋亡检测，免疫安排化学法和实时荧光定量PCR 法（RT-qPCR）别离检测凋亡相关因子Bcl-2相关X蛋白（Bax）及B细胞淋巴瘤-2蛋白（Bcl-2）蛋白及mRNA 表达。成果 与假手术组比较，在I/R模型组中，小鼠缺血脑安排中凋亡阳性细胞数量显着增高，凋亡相关因子Bcl-2蛋白及基因表达下降（P<0.01），而Bax的蛋白及基因表达增强（均P<0.01）。与I/R模型组比较，DMY组小鼠缺血脑安排凋亡阳性细胞率显着下降，Bcl-2蛋白及基因表达增强，Bax蛋白和基因表达下降（均P<0.01）。定论 DMY可减轻小鼠局灶性脑I/R损害所造成的的细胞凋亡，其抗凋亡机制可能与DMY上调Bcl-2表达、下调Bax表达有关。
[关键词]二氢杨梅素；脑缺血/再灌注损害；大脑中动脉堵塞；细胞凋亡
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）5（b）-0004-05
Study on anti-apoptosis effect and mechanism of dihydromyrcetin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in mice
GAN Lu1 DENG Zhi-jing1 WANG Xian-zhe1 SHU Qi1 LIANG Cong1 GUO Zhe HE Ping
1.Pharmaceutical College of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.Department of Emergency，the Third Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530031，China；3.Laboratory Animal Center，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China
[Abstracts]Objective To study the anti-apoptosis effect of dihydromyricetin （DMY） on acute focal cerebral ischemia/reperfusion （I/R） injury in mice.Methods Male Kunming mice were randomly divided into sham group，I/R group and DMY group （500 mg/kg）.Mice model of I/R injury was established by middle cerebral artery occlusion （MCAO） using modified thread method.Daily intragastric administration of DMY was carried out 10 days before the surgery，and 1 hour before ischemia and 12 hours after reperfusion.The brain tissues of the mice were harvested after ischemia for 3 hours and reperfusion for 24 hours.Myocyte apoptosis in the cerebral I/R brain was detected with in situ terminal deoxynucleotidyl transferase （TdT）-mediated dUTP nick-end labeling （TUNEL staining） .The protein and mRNA expression of Bax and Bcl-2 were detected by immunohistochemistry assay and real-time quantitative PCR （RT-qPCR） respectively.Results Compared with sham group，apaotosis index was significantly higher，protein and mRNA expressions of Bcl-2 were lower than those of Bax were higher in I/R model group （all P<0.01）.Compared with I/R model group，in DMY group，apoptosis index decreased significantly，the expressions of Bcl-2 were higher，those of Bax were lower （all P<0.01）.Conclusion DMY can reduce the myocyte apoptosis induced by focal I/R injury，its anti-apoptotic mechanism might be related to regulating the expressionof Bax and Bcl-2.
[Key words]Dihydromyricetin；Cerebral ischemia/reperfusion injury；Middle cerebral artery occlusion；Apoptosis
脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion injury，I/R）损害触及多种病理机制，越来越多的论据标明，细胞凋亡（apoptosis）在脑I/R损害中发挥重要的效果。二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種具有多种药用价值的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性[1]。本课题组前期研讨发现，DMY关于小鼠急性局灶性脑 I/R损害，能够起到抗氧化、抗炎的维护效果[2-3]。本研讨选用改进线栓法制备小鼠脑I/R损害模型，调查DMY对脑I/R损害后细胞凋亡及凋亡相关因子Bax、Bcl-2蛋白和基因表达的影响，进一步研讨DMY对急性脑I/R损害的抗细胞凋亡的维护效果。
1材料与办法
1.1 试验动物
体重为25～30 g的SPF级雄性昆明种小鼠，由广西医科大学试验动物中心供给并有合格证号：SCXK桂2014-0002。
1.2 首要药品与试剂
DMY（购于西安开来生物工程有限公司，纯度98.33%，批号K130311），临用前用0.5%羧甲基纤维素钠配成50 mg/ml混悬液。异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，批号217151201）。原位缺口末端标记（TUNEL）凋亡检测试剂盒（Roche，瑞士）。兔抗鼠Bax和Bcl-2一抗（北京博奥森）；SP免疫组化检测试剂盒（北京中杉）；β-actin、Bax和Bcl-2引物（Takara）；RNAiso Plus Total RNA 提取试剂盒，PrimeScript TMRT reagent kit with gDNA Eraser（perfect real time）逆转录试剂盒，SYBRRPremix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒（Takara）。
1.3首要仪器设备
R580动物麻醉机（瑞沃德生命科技有限公司）；XTZ-D体式显微镜（上海光学五厂）；DMR+Q550病理图画剖析仪（德国Leica）；7300实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。
1.4动物分组和给药办法
42只昆明小鼠随机分红3组，即动物假手术组、I/R动物模型组和DMY（500 mg/kg）组，每组14只。DMY组在造模前，每天1次，接连10 d相一起间段，灌胃给予DMY 500 mg/kg，然后在缺血前1 h给药1次，再灌注后12 h再灌胃1次；动物假手术组和I/R动物模型组相一起间段灌胃同等体积的0.5%羧甲基纤维素钠。
1.5小鼠局灶性脑I/R损害模型制备
局灶性脑I/R模型经过改进线栓法树立和完善[4]。准备好解剖显微镜和器械，麻醉后镜下当心剪开颌骨下皮肤并使用微型剪渐渐剥离，在接近气管旁找到左颈总动脉，彻底剥离出至少3 cm的长度，然后先在动脉下先穿过3根结扎线，最下边的线结扎接近近心端的动脉段，最上边的线放在最远离心脏的动脉端，使用微型剪在动脉中心方位剪开约1/2巨细的口儿，开端刺进带有硅胶光滑头部的线栓（直径为0.20～0.23 mm）约0.6 cm后，稍改动方向后再刺进0.2～0.3 cm后用预先放好的结扎线固定。在缺血3 h后，使用同法拨出线栓后结扎颈总动脉，经过24 h缺血再灌注后走多聚甲醛灌注取脑。假手术组镜下当心别离并结扎左颈总动脉，不需要插线栓。
1.6 TUNEL法测凋亡
脑细胞凋亡再灌注24 h后，每组取6只小鼠，用4%多聚甲醛灌注心脏至全死后取脑，持续放于多聚甲醛中固定24 h以上。取缺血区脑安排约3 mm巨细进行酒精梯度浓度脱水，用白腊法包埋好安排，以切片机切出每张厚度为4 μm的薄切片。进行苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下调查脑安排缺血灶的病理性改动；依据TUNEL试剂盒进程和办法进行脑安排的细胞凋亡染色。每只小鼠随机选择缺血脑安排的周边区4个互不堆叠的400倍高倍视界，别离对细胞核总数和凋亡细胞核数核算，并核算凋亡阳性细胞率（%）。凋亡阳性细胞率（%）=（凋亡阳性细胞数/总计数的细胞数）×100%。凋亡阳性细胞数和总计数的细胞数由病理图画剖析仪剖析核算。
1.7免疫安排化学法测定蛋白表达
按试剂盒阐明书进行脑Bax和Bcl-2蛋白免疫安排化学染色。每只小鼠缺血脑安排周边区随机选4个互不堆叠、互不搅扰的400高倍视界，并由软件剖析Bax和Bcl-2阳性细胞百分比（%）。
1.8 RT-qPCR测定脑Bax和Bcl-2 mRNA的基因表达
再灌注24 h后，每组另取8只小鼠，取小鼠缺血侧脑安排进行匀浆，依照试剂盒阐明抽提总RNA后，由核酸蛋白检测仪测定RNA浓度和纯度。对RNA进行逆转录取得产品cDNA，之后进行PCR反响，反响条件为：94℃ 预变性5 min；94℃ 变性30 s，35℃ 退火35 s，72℃ 延伸1 min，反响40个循环，设内参β-actin进行标化。成果剖析以2-ΔΔCt法核算相应的mRNA表达水平，即以意图基因的Ct值与β-actin的Ct值的差值ΔCt，核算2-ΔΔCt =2-（ΔCt 试验组-ΔCt 对照组），作为相对含量进行剖析。基因引物序列表见表1。
1.9计算学处理
选用SPSS 16.0计算软件对数据进行处理，一切计量材料用均数±标准差标明，组间比较选用单要素方差剖析及LSD 查验，以P<0.05为差异有计算学含义。
2成果
2.1 DMY对小鼠脑安排缺血周边区细胞凋亡的影响
镜下调查，TUNEL阳性凋亡细胞的胞核呈现出棕褐色。凋亡阳性细胞率测定成果标明，假手术组简直无TUNEL阳性细胞表达[（8.67±2.08）%]。与假手术组比较，I/R模型组TUNEL阳性细胞数量[（80.33±5.50）%]显着添加（P<0.01）；而DMY组中TUNEL阳性细胞数量[（31.00±3.61）%]较I/R模型组显着削减（P<0.01）。成果见图1、图2。
Bcl-2阳性染色首要坐落胞质。假手术组可见很多阳性面积表达[（71.00±6.04）%]，与假手术组比较，模型组Bcl-2阳性细胞数量[（30.40±3.51）%]削减（P<0.01）；与而与I/R模型组比较，DMY能显着添加Bcl-2阳性细胞数量[（46.60±2.07）%]（P<0.01）。成果见图5、图6。
2.3 DMY对小鼠缺血脑安排Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响
进行相对表达量核算后可得，与假手术组[（0.97±0.03）倍]比较，I/R模型组的Bax mRNA表达量[（10.81±1.62）倍]显着上调（P<0.01）；与I/R模型组比较，DMY组显着下调Bax mRNA表达量[（5.65±0.37）倍]（P<0.01）。在I/R模型组中Bcl-2 mRNA表达量[（0.10±0.01）倍]较假手术组[（1.02±0.03）倍]显着下降（P<0.01）；与I/R模型组比较，DMY组Bcl-2 mRNA表达量[（0.29±0.51）倍]显着添加（P<0.01）。成果见图7。
3评论
本研讨在树立小鼠大脑I/R损害模型的基础上调查DMY对小鼠局灶性脑缺血再灌注后抗细胞凋亡的维护机制。脑缺血再灌注损害之后可引起以细胞凋亡为首要机制的炎症损害[5]。脑缺血后，细胞在形状上体现舒展，细胞空隙加大并脱离，密度添加引起通透性改动，核质浓缩，核膜核仁发作决裂。脑缺血再灌注后，首要经过缺血细胞中的钙离子堆积、氧化应激、线粒体因从来诱导细胞凋亡的发动[6]。经过TUNEL染色后发现，缺血区呈现显着细胞固缩变形，体积变小，核染色质呈现边集化，与相关文献的研讨成果一起[7]。脑I/R损害后，缺血区细胞凋亡数量显着增多，而DMY能够削减缺血区细胞凋亡的数量。研讨成果提示DMY可经过抗凋亡效果维护脑I/R损害。
炎症反响直接参与损害细胞的一起又可经过线粒体介导的内源性途径[8]、细胞外表的逝世受体如Fas和肿瘤坏死因TNF-R引发的外源性途径[9-10]等诱导细胞凋亡直接导致损害。在脑血管疾病中，细胞中线粒体功用急性紊乱是首要发作的，也是根本的要素[11]。脑缺血再灌注损害首要触及线粒体功用的妨碍和衰竭，包含氧化应激、内质网裂解和超微结构损害，导致细胞首要经过内源性途径发挥凋亡效果，所以内途径通路在缺血再灌注损害中体现得尤为重要。内途径首要是由Bax和Bcl-2这两个相互为拮抗的蛋白经过调理线粒体膜的通透性来激活胱冬肽酶-3（caspase-3），然后发挥效果[12]。作为体内重要的凋亡调理因子，存活基因Bcl-2的首要效果是按捺细胞凋亡，促凋亡基因Bax则经过效果于线粒体开释其间的凋亡相关分子Apaf-1，使之与Cytc一起激活caspase信号转导途径。Bax和Bcl-2的份额失衡，使促凋亡因子细胞色素C被开释到胞质中，然后和caspase-9构成复合物后，作为细胞凋亡内源性途径的发起者，进一步激活下流caspase-3，而且发动凋亡的进程诱导细胞凋亡[13]。针刺对神经系统疾病的抗细胞凋亡的首要机制是Bcl-2表达上谐和Bax和caspase表达下降[14]；三七总皂苷R1激活Bcl-2的表达以及经过按捺Bax蛋白表达的来削减脑梗死面积，削减细胞凋亡[15]；DMY逆转由3-硝基丙酸诱导的大鼠行为缺点和纹状体安排病理损害，经过诱导Bcl-2的上调，使细胞凋亡显着削减[16]。Bcl-2是按捺凋亡因子，所以说Bax和Bcl-2的表达影响着细胞凋亡的发作，而这不仅仅是体现在脑血管疾病中，在抗肿瘤中的效果也是如此。左彦珍等[17]发现，DMY能够经过下调Bcl-2/Bax的比值来促进宫颈癌HeLa 细胞凋亡而起到抗肿瘤效果；DMY还能够经过维护氧化应激，下调半胱氨酸蛋白酶活化和上调Bcl-2的蛋白表达，诱导骨肉瘤细胞凋亡[18]。综上所述，细胞凋亡首要依靠内源性途径，Bax和Bcl-2作为介导内源性途径的凋亡相关因子扮演着重要人物。
本试验经过免疫组化法测定Bcl-2和Bax的阳性细胞表达，并进一步用荧光定量PCR检测相关mRNA表达。经过试验标明，脑I/R损害后，I/R模型组Bax蛋白表达和mRNA表达均显着上调，而Bcl-2蛋白和mRNA表达均显着下降，Bax>Bcl-2，阐明脑I/R损害后脑神经细胞抗凋亡才能下降，体现为促进凋亡。而在DMY组，DMY显着按捺Bax上调，上调Bcl-2蛋白和mRNA表达。由此可知，预先给予DMY能削减脑I/R损害细胞内损害后细胞内Bax/Bcl-2病理性调控所引发的凋亡。提示细胞凋亡的前期，線粒体在核染色体DNA还未改动之前就现已呈现改动，阐明其凋亡进程可能有线粒体来完结[19]。以上成果提示DMY能够经过按捺I/R损害后的细胞凋亡反响发挥神经维护效果，机制可能语Bax/Bcl-2介导的凋亡途径有关[20]。
综上所述，本试验成果标明DMY能够减轻神经元凋亡，一起下调Bax蛋白及mRNA表达，上调Bcl-2蛋白和mRNA表达，提示DMY对脑I/R损害的神经维护效果可能归因于对立细胞凋亡，其机制可能与调理Bax/Bcl-2凋亡途径有关。
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（收稿日期：2018-03-19 本文修改：许俊琴）
