蒙小丽 龙玲 陈小勇
[摘要]意图 构建pH呼应性的口服甲氨蝶呤纳米投递体系，以进步甲氨蝶呤的口服生物利费用。办法 依据聚乙烯亚胺与甲氨蝶呤之间的多重非共价键效果力，选用透析法制备甲氨蝶呤纳米粒，调查测定其描摹、粒径、电位、载药功能等理化特征，并经过体表里药物开释试验开始点评该纳米粒体系的pH呼应性及其口服生物利费用。成果 经过该法制备的甲氨蝶呤纳米粒的粒径均一、巨细可控、外表带正电荷，具有优异的载药功能及显着的pH呼应性开释行为。该纳米粒在pH=1.2的环境中不开释，而在pH=7.4的环境中可快速开释。相较于甲氨蝶呤原料药和片剂，甲氨蝶呤纳米粒口服后血药浓度达峰时刻更短，峰浓度更高，并具有更大的药时曲线下面积。定论 该纳米粒可明显进步甲氨蝶呤的口服生物利费用，并有望依据此增强甲氨蝶呤口服抗肿瘤活性，具有较好的运用远景。
[关键词]纳米粒；甲氨蝶呤；聚乙烯亚胺；口服给药
[中图分类号] R944.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）2（a）-0020-05
[Abstrcact]Obiective To construct pH-responsive oral Methotrexate （MTX） nanoparticles based polyethylenimine （PEI） for improving the oral bioavailability of Methotrexate.Methods MTX nanoparticles were prepared by dialysis with MTX and PEI based on multiple non-covalent interactions between them.Physicochemical characteristics of nanoparticles containing morphology，particle size，zeta potential，drug loading，and entrapment efficiency were observed and determined，and in vivo and in vitro drug release profiles were employed to evaluate the pH responsive release ability and the oral bioavailability of MTX/PEI nanoparticles.Results The nanoparticles were successfully prepared as discrete and uniform spheres with positive charges，which exhibited an excellent MTX loading performance，and an obvious pH responsive release behavior that no released in pH=1.2 solvent，but rapidly released in pH=7.4 solvent.Compared with the raw MTX and tablet of MTX，MTX/PEI nanoparticles showed a shorter peak time and higher peak concentration after oral administration，and also a larger area undercurve （AUC）.Conclusion Oral bioavailability of MTX is significantly improved by MTX/PEI nanoparticle system.Based on this，the MTX/PEI nanoparticlesystem is expected to significantly enhance the oral MTX antitumor activity with a good prospect in application.
[Key words]Nanoparticles；Methotrexate；Polyethyleneimine；Oral administration
甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是一種细胞毒性药物，被广泛运用于急性白血病、乳腺癌、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎、头颈部肿瘤、骨肿瘤等多种恶性肿瘤疾病的医治[1]。作为叶酸类似物，MTX可经过按捺二氢叶酸还原酶，导致DNA的生物组成受阻，然后按捺肿瘤细胞的增殖，是其抗肿瘤的首要机制[1-5]。但是，因为上皮细胞的增殖较快，增殖周期较短（24～48 h），MTX在抗肿瘤增殖的一起，对上皮细胞的增殖相同具有较强的按捺效果[6]。虽然MTX口服制剂较打针剂具有愈加安全、便利、患者依从性高的特色，特别是关于削减打针化疗药物带来的血管损害具有十分活跃的效果；但是，因为MTX对上皮细胞增殖的按捺，其与消化道上皮细胞的长时刻触摸会导致严峻的消化道反响，易引起口腔炎、胃炎及消化道出血等，这是现在MTX口服运用的首要妨碍[7-8]。近年来，研讨者为进步MTX的口服生物利费用与口服安全性，已经过运用纳米制剂取得了部分发展，但因为传统纳米粒的载药功能较低，且无环境敏感性，对MTX口服生物利费用与安全性的进步仍十分有限[9-13]。
研讨提示，聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）与吲哚美辛等羧基小分子药物可经过氢键、静电效果等多重非共价键效果力自拼装构成具有高载药量的pH呼应性口服纳米释药体系[14-16]。MTX为叶酸类似物，其与吲哚美辛类似，在化学结构中含两个羧基。明显，MTX相同有望与PEI之间经过静电效果、氢键效果等自拼装构成具有pH呼应性的高载药聚合物纳米粒。本研讨拟运用PEI和MTX之间的多重非共价键效果力来构建具有高载药量的pH呼应性的口服pH呼应性纳米释药体系，并对其pH呼应性药物开释行为与体内药动学进行开始研讨，评论其在MTX口服投递中的运用潜力。
1资料与办法
1.1资料
PEI（分子量为25 kDa，Sigma，美国），MTX（Sigma，美国，纯度≥99%）；MTX片（上海信谊药厂有限公司）；透析袋（截留分子量：3500 Da，北京经科宏达生物有限公司）；DMSO（剖析纯，重庆科隆化工有限公司）；乙醇（剖析纯，重庆科隆化工有限公司）；其他试剂均为剖析纯。
1.2仪器
20A高效液相色譜仪（日本Shimadzu公司）；754型紫外分光光度计（上海丙林电子科技有限公司）；SXJQ-1型数显直流无级调速搅拌器（郑州长城科工贸公司）；HZP-150型恒温振动培养箱（上海精宏试验设备有限公司）；JEM-2100型透射电子显微镜（日本JEOL公司）；Nano-zs型激光粒度Zeta电位剖析仪（美国Malvern公司）；BL3-120A超声清洗器（上海比郎仪器有限公司）。
1.3纳米粒的制备
称取必定量的MTX与PEI，溶于1 ml二甲基亚砜中，转移至透析袋中（MWCO=3500），透析袋放入水中透析，隔必定时刻交换去离子水，透析24 h后，取出透析袋中溶液，冷冻干燥后即得MTX/PEI纳米粒。
1.4纳米粒的形状调查
选用透射电子显微镜（TEM）调查纳米粒的形状。纳米粒粒径与Zeta电位经过激光粒度Zeta电位剖析仪测定。
1.5 MTX的载药量及包封率测定
精细称取10 mg纳米粒冻干粉，选用乙醇溶解后，转移至10 ml容量瓶中定容，定容后溶液于紫外分光光度计306 nm处以乙醇为空白测定吸光度，代入规范曲线核算其浓度。别离按公式（1）与（2）核算纳米粒的载药量和包封率。
载药量（%）=拼装体中所含药物量（mg）/拼装体总量（mg）×100% （1）
包封率（%）=载药量（%）/理论载药量（%）×100% （2）
1.6纳米粒pH呼应开释行为点评
按MTX与PEI按投药分量比20/10制备MTX/PEI纳米粒，透析后的溶液取0.5 ml转移至透析袋中，先将其放入40 ml pH 1.2的PBS开释介质中进行体外开释，每过一段时刻从开释介质中取出4 ml，并弥补4 ml新鲜开释介质。2 h后将40 ml开释介质悉数取出，弥补40 ml pH 7.4的PBS开释介质，定时取4 ml开释介质，并弥补4 ml新鲜开释介质。称取必定量的MTX原料药，放入透析袋中，按上述办法进行pH呼应开释行为的点评。不一起刻点的药物浓度经过紫外分光光度计在306 nm的测定波长下测定，并依据规范曲线核算甲氨喋呤的累积开释量和累积开释百分比，核算后制作开释曲线。
1.7纳米粒的体内药物开释动力学研讨
SD雄性大鼠购置于第三军医大学动物试验中心，体重200～250 g，灌胃前24 h禁食，分为MTX原料药组、MTX片剂组和MTX/PEI纳米粒组，每组SD大鼠4只。按MTX含量10 mg/kg给予大鼠灌胃，其间纳米粒组中甲氨喋呤载药量为57.2%。口服灌胃给药后必定时刻点取血，3000 r/min离心10 min后取血浆，参加茶碱内标溶液 50 μl，涡旋10 s，加乙腈1 ml，涡旋60 s，16 000 r/min离心10 min，汲取上清液1 ml置另一离心管中，60℃氮气吹干，残渣用活动相120 μl溶解，离心，上清液过滤后取20 μl进样。血药浓度的测定参照文献报导的高效液相色谱法测定[17]，活动相为磷酸盐缓冲液（pH=6.6）-甲醇（82∶18）；检测波长：306 nm 和254 nm；流速：1 ml/min；柱温：30℃。
1.8血药浓度曲线下面积的核算
选用DAS 3.0软件核算取得，核算成果选用PASW 18.0软件对两组数据以独立样本t查验办法进行均值比较。
2成果
2.1纳米粒的理化功能
图1为不同投药分量比下制备的MTX/PEI纳米粒在透射电镜下的描摹，可以看到MTX与PEI在5/10、10/10与20/10三个投药分量比下均可构成粒径均一、形状杰出的球形纳米粒。
进一步选用激光粒度Zeta电位剖析仪对纳米粒的粒径及外表电位进行测定，可以发现纳米粒的粒径巨细与投药分量比成正比。跟着MTX/PEI投药分量比的添加，纳米粒的粒径随之增大。其间，投药分量比5/10、10/10与20/10的MTX/PEI纳米粒的粒径别离为（124.1±0.402）nm、（133.5±1.732）nm与（178.7±0.400）nm（图2A）。不同投药分量比纳米粒的PDI值别离为0.214±0.071、0.231±0.059、0.205±0.081，提示不同投药分量比纳米粒的粒径散布均较为均一。对纳米粒的Zeta电位测定发现，不同投药分量比的纳米粒外表均带正电荷，提示在纳米粒的外表首要由阳离子聚合物PEI构成。一起，跟着MTX/PEI投药分量比的添加，纳米粒的zeta电位则随之下降。MTX/PEI投药分量比5/10、10/10与20/10的MTX/PEI纳米粒的zeta电位别离为（68.2±6.00）mV、（63.3±1.4）mV与（58.2±1.06）mV（图2B），这首要是因为甲氨喋呤在纳米粒中所占份额添加，PEI的正电荷被MTX的负电荷中和更多。
2.2纳米粒的载药功能
纳米粒的载药量与包封率是点评纳米粒载药功能的重要目标，经过紫外分光光度计测定MTX/PEI纳米粒的载药量和包封率发现，MTX/PEI投药分量比在5/10～20/10的范围内时，纳米粒的载药量及包封率与其的投药分量比成正相关；当MTX/PEI投药分量比为20/10时，其载药量可高抵达（56.3±7.49）%，包封率可抵达（84.5±11.2）%（图3），具有优异的载药功能。
2.3 MTX/PEI纳米粒的pH呼应性开释行为
图4为MTX/PEI纳米粒在pH=1.2与pH=7.4介质环境下的累积药物开释曲线，MTX/PEI纳米粒在pH=1.2的开释介质中几乎不开释，当将其转移至pH=7.4的开释介质中时，在24 h内快速开释超越90%；而MTX原料药在pH=1.2开释介质中开释速度高于纳米粒，2 h内开释了20%左右的药物，而在pH=7.4中开释速度则明显的低于纳米粒，24 h内仅开释约70%的药物（图4）。
2.4 MTX/PEI纳米粒的体内开释行为
图5为MTX原料药、MTX片剂与MTX/PEI纳米粒经口服给药后在大鼠血浆中的药时曲线。如图所示，MTX/PEI纳米粒经口服后，较MTX原料药与MTX片剂的吸收速度大大进步，其达峰时刻更短，在给药后160 min后即抵达达峰浓度，其Cmax可抵达（1.61±0.23）μg/ml，并在24 h均坚持较高的血药浓度（>0.8 μg/ml）。而MTX原料药与MTX片剂在给药后220 min后别离抵达达峰浓度，其Cmax别离为（0.85±0.13）μg/ml与（1.13±0.25）μg/ml。
随后，进一步选用DAS 3.0软件对MTX原料药、MTX片剂与MTX/PEI纳米粒的口服生物利费用进行核算，MTX/PEI纳米粒可明显进步MTX的生物利费用，其AUC值可抵达（118.4±13.5）μg/（L·h），而MTX原料药与MTX片剂的AUC值则明显低于MTX/PEI纳米粒，别离为（37.9±5.66）μg/（L·h）与（65.4±3.91）μg/（L·h）（图6）。
3评论
MTX是临床上广泛运用的小分子药物，适用于急性白血病、乳腺癌、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎等肿瘤医治以及顽固性一般银屑病、体系性红斑狼疮、皮肌炎等本身免疫病。其效果机制首要为按捺二氢叶酸还原酶而抵达阻止肿瘤细胞DNA组成，然后按捺肿瘤细胞的成长与繁衍。甲氨喋呤为叶酸类似物，分子结构中含有2个羧基，为羧基小分子药物，其间的羧基可与PEI之间的氨基发作静电效果与氢键效果；一起MTX中的疏水基团则可与PEI的长碳链之间构成疏水效果，然后构成了MTX与PEI之间的多重非共价键效果力。
本研讨依据甲氨喋呤与PEI之间的多重非共价键效果力，成功制备了MTX/PEI纳米粒。经过透射电镜调查，可以看到该纳米粒形状杰出，为十分均匀的球形颗粒，粒径约为100 nm。经过激光粒度Zeta电位剖析仪测定的粒径散布成果与透射电镜调查成果类似，不同MTX/PEI投量分量比的纳米粒其粒径散布在70～100 nm，而且可经过投量分量比的调理来完成纳米粒粒径的可控。因为PEI为阳离子聚合物，该纳米粒外表带正电荷。研讨提示，肠道黏膜外表带着负电荷，外表带正电荷的纳米粒更易黏附于肠道黏膜，添加肠道对纳米粒的吸取，因而，MTX/PEI纳米粒的外表正电荷性质有望协助纳米粒在口服给药后黏附于肠道外表，然后添加肠道保存时刻，进步药物的吸收。传统的纳米粒一般依据单一的弱疏水效果力组成，需求较多的聚合物组成来负载药物，因而其载药量一般较低[5，9-10]。MTX/PEI纳米粒经过氢键、静电效果等多重非共价键效果力组成，本研讨成果显现，其载药量相关于传统的MTX纳米粒的载药量有大幅进步，跟着投药量的添加，载药量呈上升趋势，最高可达55%以上，包封率可抵达85%以上，提示MTX与PEI经过多重非共价键彼此效果构建的纳米粒具有优异的药物负载才能。
最终，本研讨对MTX纳米粒的体外释药特性和体内药动学进行了开始评论。MTX的解离常数pKa=3.4、pH=1.2时MTX中的羧基处于质子化水平，药物与聚合物间强的非共价键彼此效果力依然存在，因而，MTX/PEI纳米粒在pH=1.2的开释介质中几乎不开释。当纳米粒处于pH=7.4的开释介质中时，MTX中的羧基处于解离状况，破坏了药物与聚合物间的氢键，导致了纳米粒的解缔合，MTX然后在pH=7.4的开释介质中可以快速开释，在24 h内开释即超越90%。随后的体内药动试验显现，MTX/PEI纳米粒其pH呼应性的药物开释行为可削减药物在胃酸中的开释，添加药物在肠道中的开释，然后相较MTX原料药和MTX片剂明显进步MTX的口服生物利费用[18]。别的，MTX/PEI纳米粒生物利费用进步的机制还有可能是因其外表带有正电荷，可吸附于带负电荷的小肠黏膜层，然后使载药拼装体较长时刻停留在小肠，添加了肠道保存时刻，进而促进了MTX的口服生物利费用[19]；一起，MTX/PEI纳米粒灌胃后在小肠内部分经肠内吞效果吸收进入全身循环，促进了MTX的吸收[20]。
综上所述，MTX/PEI纳米粒可经过其pH呼应性开释行为及肠道黏附才能，大幅进步MTX的口服生物利费用，有望增强MTX的口服抗肿瘤活性。一起，该纳米粒具有优异的载药功能，相较于传统纳米粒具有必定运用优势，且制备工艺简略、粒径均一、巨细可控，为进步MTX的口服抗肿瘤活性奠定了运用根底，有较好的运用远景。
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