于百富+++++陈辉
[摘要] 意图 树立一起测定银黄颗粒中三种黄酮类成分（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素）的含量的高效液相色谱办法。 办法 选用Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇-0.2%甲酸水溶液为活动相，梯度洗脱，流速1.0 ml/min，检测波长为275 nm，柱温30℃，进样量20 μl。 成果 三种成分在树立的办法下别离杰出，在调查的浓度规模内，浓度与峰面积之间呈杰出的线性关系（r>0.9997）；回收率（n=9）均在94.4%～1a04.7%规模，RSD均<2.1%。 定论 本办法简洁、精确，精细度高，重复性好，能够用于银黄颗粒的质量操控。
[关键词] 高效液相色谱法；银黄颗粒；黄酮类成分；含量测定
[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（a）-0053-03
银黄颗粒是由金银花和黄芩两味中草药提取物组成的复方制剂，具有清热、利咽、解毒效果。临床上首要用于医治外感风热引起的咽干、咽痛、发热以及扁桃体炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染等多种疾病。黄芩富含多种物质，其间含量较高而且具有明显药理活性的化合物是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷等黄酮类化合物[1-7]。银黄颗粒大多以黄芩苷和绿原酸作为质量操控目标[8-11]，监测其内涵质量，因这种简洁单一的质量操控形式存在必定缺点，为不合法增加埋下了危险。
我国药典（2010版）[12]对银黄颗粒的质控是经过测定绿原酸和黄芩苷两种成分，对这两种测定成分选用不同的样品处理办法及色谱条件，过程繁琐，且对具有活性成分的黄芩素、汉黄芩苷未进行有用质控。
挑选黄芩苷等三种成分作为质量操控的目标，可有用地反映银黄颗粒真实的内涵质量，并为全面点评其质量操控供给有用根据。本实验以金银花和黄芩两种中药材的已知有用成分为根底，使用梯度洗脱法构建能一起测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素三种化学成分的高效液相色谱法，旨在为银黄颗粒的内涵质量操控供给更好的根据。
1 仪器与试剂
美国Agilent 1260高效液相色谱仪体系，AE240电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多）。对照品购于我国药品生物制品检定所；银黄颗粒来自本院和药店，生产厂家及药品批次别离为：①云南永安制药有限责任公司（批号1100303）、②西安交大药业（集团）有限责任公司（批号110624）、③河南宛西制药股份有限责任公司（批号110701）。使用的试剂中，乙腈、甲酸、乙酸、甲醇为色谱纯，实验用水为纯化水，其他所用试剂均为剖析纯。
2 办法与成果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；活动相：甲醇（A）-0.2%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：（A：0～15 min，20%；15～40 min，20%～40%；40～80 min，40%～45%；80～90 min，45%～50%；90～120 min，50%～55%；120～135 min，55%）；流速：1.0 ml/min；检测波长：275 nm；柱温：30℃；进样量：20 μl。
2.2 供试品溶液的制备
将银黄颗粒去外包装，用恰当办法研细，精细称取细粉1.0 g，置于50 ml量瓶中，参加甲醇40 ml，超声提取20 min（功率350 W，频率45 KHz），放至室温，用甲醇稀释至刻度。混合均匀，取上清液过滤，即得。
2.3 对照品储藏液的制备
精细称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的对照品适量，别离用甲醇溶解稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/ml的对照品储藏溶液，备用。
2.4 体系适用性实验
别离精确量取适量的各对照品储藏液，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素浓度别离为400.00、100.00、80.00 μg/ml的混合溶液作为对照品。取对照品溶液、供试品溶液，别离测得三种黄酮类成分的混合对照品、样品溶液的色谱图（图1）。经过核算别离度>1.5，理论板数均>3000。
图1 275 nm下的HPLC-DAD色谱图
A.混合对照品，B.银黄颗粒样品；1.黄芩苷，2.汉黄芩苷，3.黄芩素
2.5 线性关系的调查、检出限和定量限
精细汲取混合对照品储藏液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，逐渐稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，进行测定。以信噪比10∶1求得定量限（LOQ），以信噪比3∶1求得检出限对照品（LOD）。按规则色谱条件测定。成果标明三种化合物均有杰出的线性关系，定量检出限（S/N=10）在1.08～1.55 μg/ml（表1）。
表1 三种化合物的回归方程、相关系数、线性规模和检出限（n=3）
2.6 精细度实验
称取上述实验已研细的银黄颗粒细粉1.0 g，精细称定，按规则办法制备供试品溶液，接连进样6次，测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的峰面积，成果上述3种黄芩黄酮类成分峰面积的RSD别离为0.68%、0.19%、0.85%，标明该测定办法批内精细度杰出。取上述实验已研细的银黄颗粒细粉1.0 g，精细称定，按规则的办法制备供试品溶液，接连进样6次样品3批，核算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素峰面积的RSD别离为1.35%、0.96%、1.59%，标明仪器的批间精细度杰出。
2.7 安稳性实验
精细称取银黄颗粒细粉1.0 g，制备成供试品溶液，按2.1相同色谱条件，别离于0、4、8、12、24 h进样20 μl测定。经过核算黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素峰面积的RSD别离为1.77%、1.56%、1.81%。标明供试品溶液在室温下放置24 h银黄颗粒中的三种被测成分均较安稳。
2.8 重复性实验
精细称取银黄颗粒细粉1.0 g，平行制备6份供试品溶液，测定峰面积并核算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素均匀含量别离为50.22、0.43、0.45 mg/g，RSD别离为0.71%、1.44%、1.48%。标明该办法具有杰出的重复性。
2.9 加样回收率实验
取已测定含量的银黄颗粒细粉0.5 g合计9份，别离按样品含量：对照品参加量为（0.5～1.5）∶1的份额参加必定量的对照品溶液，按规则办法制备实验用供试品溶液，测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的加样回收率及RSD。成果上述三种黄芩黄酮类成分，加样均匀回收率别离为106.8%、99.9%、100.5%（表2），标明该办法的精确度杰出。
表2 银黄颗粒中三种黄酮类成分的回收率实验成果
2.10 样品含量的测定
别离测定3个不同厂家批号的银黄颗粒中三种黄酮类化合物的含量，能够看出，生产厂家不同银黄颗粒中三种被测成分的含量有较大差异（表3），因而主张生产厂家要对批间生产过程进行有用操控，保证其有用成分的含量根本安稳。
表3 三批银黄颗粒中三种化合物的含量测定成果（mg/g，n=3，x±s）
3 评论
3.1 测定波长的挑选
本研讨在190～400 nm波长规模内对黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素三种化合物进行了紫外全波长扫描，其别离在277、273、275 nm波利益有最大吸收峰，故挑选275 nm作为测定波长。
3.2 色谱条件的挑选
乙腈和甲醇是常用的液相色谱洗脱剂，经过比较，两者都能够发生较好的别离效果，但甲醇本钱和毒性更低，故挑选甲醇作为洗脱剂。因为黄酮类成分在酸性环境下能到达更好的峰形，所以在水相中参加0.2%的甲酸，经过优化梯度洗脱，终究到达较好的峰形和别离度。
本文构建了银黄颗粒中三种黄酮类成分含量的测定办法，该办法简洁、精确，精细度高，重复性好，能为银黄颗粒的全面质量操控供给根据。
[参考文献]
[1] 陈勇川，谢林利，熊丽蓉，等.黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的反转效果研讨[J].我国药房，2008，19（9）：644-649.
[2] 吴莹，金叶智，吴珺，等.黄芩首要成分体外抗甲型流感病毒效果的研讨[J].北京中医药大学学报，2010，33（8）：541-545.
[3] 周锡钦，张庆英，梁鸿，等.黄芩中首要黄酮类成分的含量剖析[J].我国中药杂志，2009，34（22）：2910-2915.
[4] 李小芩，孙晓红，蔡爽，等.选用UPLC-ESI-MS/MS以及主成分聚类剖析研讨不同种类金银花的化学成分及其差异[J].药学学报，2009，44（8）：895-904.
[5] Han J，Ye M，Xu M，et al.Characterization of flavonoids in the traditional Chinese herbal medicine-Huangqin by liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，848（2）：355-362.
[6] 马双成，刘燕，毕培曦，等.金银花药材中抗呼吸道病毒感染的黄酮类成分的定量研讨[J].药物剖析杂志，2006， 26（4）：426-430.
[7] 阚红玉，宋殿荣，王跃飞，等.HPLC法一起测定黄芩中5种黄酮类成分的含量[J].我国药房，2010，21（11）：1016-1018.
[8] 黄雄，黄嬛，黄佳，等.HPLC一起测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].我国现代使用药学，2009，26（5）：417-419.
[9] 白雁，张威，王星，等.近红外光谱法测定不同厂家银黄颗粒中黄芩苷含量[J].我国中药杂志，2010，35（2）：166-168.
[10] 张婷，美尔哈巴·热西提，林潇，等.HPLC-MS/MS法测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷[J].中草药，2012，43（4）：711-713.
[11] 王玲玲，王凌，杨菲，等.RP-HPLC测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].我国实验方剂学杂志，2012， 18（12）：124-126.
[12] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：我国医药科技出版社，2010：84.
（收稿日期：2014-05-26 本文修改：李亚聪）
2.8 重复性实验
精细称取银黄颗粒细粉1.0 g，平行制备6份供试品溶液，测定峰面积并核算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素均匀含量别离为50.22、0.43、0.45 mg/g，RSD别离为0.71%、1.44%、1.48%。标明该办法具有杰出的重复性。
2.9 加样回收率实验
取已测定含量的银黄颗粒细粉0.5 g合计9份，别离按样品含量：对照品参加量为（0.5～1.5）∶1的份额参加必定量的对照品溶液，按规则办法制备实验用供试品溶液，测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的加样回收率及RSD。成果上述三种黄芩黄酮类成分，加样均匀回收率别离为106.8%、99.9%、100.5%（表2），标明该办法的精确度杰出。
表2 银黄颗粒中三种黄酮类成分的回收率实验成果
2.10 样品含量的测定
别离测定3个不同厂家批号的银黄颗粒中三种黄酮类化合物的含量，能够看出，生产厂家不同银黄颗粒中三种被测成分的含量有较大差异（表3），因而主张生产厂家要对批间生产过程进行有用操控，保证其有用成分的含量根本安稳。
表3 三批银黄颗粒中三种化合物的含量测定成果（mg/g，n=3，x±s）
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3.1 测定波长的挑选
本研讨在190～400 nm波长规模内对黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素三种化合物进行了紫外全波长扫描，其别离在277、273、275 nm波利益有最大吸收峰，故挑选275 nm作为测定波长。
3.2 色谱条件的挑选
乙腈和甲醇是常用的液相色谱洗脱剂，经过比较，两者都能够发生较好的别离效果，但甲醇本钱和毒性更低，故挑选甲醇作为洗脱剂。因为黄酮类成分在酸性环境下能到达更好的峰形，所以在水相中参加0.2%的甲酸，经过优化梯度洗脱，终究到达较好的峰形和别离度。
本文构建了银黄颗粒中三种黄酮类成分含量的测定办法，该办法简洁、精确，精细度高，重复性好，能为银黄颗粒的全面质量操控供给根据。
[参考文献]
[1] 陈勇川，谢林利，熊丽蓉，等.黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的反转效果研讨[J].我国药房，2008，19（9）：644-649.
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[6] 马双成，刘燕，毕培曦，等.金银花药材中抗呼吸道病毒感染的黄酮类成分的定量研讨[J].药物剖析杂志，2006， 26（4）：426-430.
[7] 阚红玉，宋殿荣，王跃飞，等.HPLC法一起测定黄芩中5种黄酮类成分的含量[J].我国药房，2010，21（11）：1016-1018.
[8] 黄雄，黄嬛，黄佳，等.HPLC一起测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].我国现代使用药学，2009，26（5）：417-419.
[9] 白雁，张威，王星，等.近红外光谱法测定不同厂家银黄颗粒中黄芩苷含量[J].我国中药杂志，2010，35（2）：166-168.
[10] 张婷，美尔哈巴·热西提，林潇，等.HPLC-MS/MS法测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷[J].中草药，2012，43（4）：711-713.
[11] 王玲玲，王凌，杨菲，等.RP-HPLC测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].我国实验方剂学杂志，2012， 18（12）：124-126.
[12] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：我国医药科技出版社，2010：84.
（收稿日期：2014-05-26 本文修改：李亚聪）
2.8 重复性实验
精细称取银黄颗粒细粉1.0 g，平行制备6份供试品溶液，测定峰面积并核算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素均匀含量别离为50.22、0.43、0.45 mg/g，RSD别离为0.71%、1.44%、1.48%。标明该办法具有杰出的重复性。
2.9 加样回收率实验
取已测定含量的银黄颗粒细粉0.5 g合计9份，别离按样品含量：对照品参加量为（0.5～1.5）∶1的份额参加必定量的对照品溶液，按规则办法制备实验用供试品溶液，测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的加样回收率及RSD。成果上述三种黄芩黄酮类成分，加样均匀回收率别离为106.8%、99.9%、100.5%（表2），标明该办法的精确度杰出。
表2 银黄颗粒中三种黄酮类成分的回收率实验成果
2.10 样品含量的测定
别离测定3个不同厂家批号的银黄颗粒中三种黄酮类化合物的含量，能够看出，生产厂家不同银黄颗粒中三种被测成分的含量有较大差异（表3），因而主张生产厂家要对批间生产过程进行有用操控，保证其有用成分的含量根本安稳。
表3 三批银黄颗粒中三种化合物的含量测定成果（mg/g，n=3，x±s）
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3.1 测定波长的挑选
本研讨在190～400 nm波长规模内对黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素三种化合物进行了紫外全波长扫描，其别离在277、273、275 nm波利益有最大吸收峰，故挑选275 nm作为测定波长。
3.2 色谱条件的挑选
乙腈和甲醇是常用的液相色谱洗脱剂，经过比较，两者都能够发生较好的别离效果，但甲醇本钱和毒性更低，故挑选甲醇作为洗脱剂。因为黄酮类成分在酸性环境下能到达更好的峰形，所以在水相中参加0.2%的甲酸，经过优化梯度洗脱，终究到达较好的峰形和别离度。
本文构建了银黄颗粒中三种黄酮类成分含量的测定办法，该办法简洁、精确，精细度高，重复性好，能为银黄颗粒的全面质量操控供给根据。
[参考文献]
[1] 陈勇川，谢林利，熊丽蓉，等.黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的反转效果研讨[J].我国药房，2008，19（9）：644-649.
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[7] 阚红玉，宋殿荣，王跃飞，等.HPLC法一起测定黄芩中5种黄酮类成分的含量[J].我国药房，2010，21（11）：1016-1018.
[8] 黄雄，黄嬛，黄佳，等.HPLC一起测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].我国现代使用药学，2009，26（5）：417-419.
[9] 白雁，张威，王星，等.近红外光谱法测定不同厂家银黄颗粒中黄芩苷含量[J].我国中药杂志，2010，35（2）：166-168.
[10] 张婷，美尔哈巴·热西提，林潇，等.HPLC-MS/MS法测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷[J].中草药，2012，43（4）：711-713.
[11] 王玲玲，王凌，杨菲，等.RP-HPLC测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].我国实验方剂学杂志，2012， 18（12）：124-126.
[12] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：我国医药科技出版社，2010：84.
（收稿日期：2014-05-26 本文修改：李亚聪）
