陈兴田 陈广通 汪冬庚 黄金华
[摘要]意图调查复方金蟾胶囊对小鼠移植性肝癌HepA腹水瘤的按捺效果。办法将50只BALB/C小鼠随机分为模型组、对照组（环磷酰胺，CTX）、金蟾小剂量组、金蟾中剂量组和金蟾大剂量组，每组10只。选用移植性HepA肝癌腹水瘤模型，进行按捺肿瘤的试验；给药完毕第3天，摘取小鼠肿瘤安排和胸腺安排核算抑瘤率和胸腺指数，用流式细胞仪调查肿瘤细胞周期及细胞凋亡状况；取血测定血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。成果与模型组比较，金蟾各剂量组均能够添加小鼠胸腺分量及胸腺指数（P<0.01），显着按捺肿瘤成长；与模型组比较，对照组的肿瘤细胞仅G2/M期份额添加（P<0.05），金蟾小剂量组仅S期细胞份额增高（P<0.05）；金蟾大剂量组G2/M期、S期细胞份额均高于模型组。定论复方金蟾胶囊对小鼠移植性HepA肝癌腹水瘤具有显着按捺效果。
[关键词]肝癌；BALB/C小鼠；环磷酰胺；金蟾胶囊
[中图分类号]R735.7 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2012）12（a）-0012-03
跟着工业化的发展的加快，各种污染就随之而来，癌症的发作率也逐步上升。在长江和黄海的接壤的启海乡村，肝癌成为最常见的恶性肿瘤。为此，国家专门树立江苏省启东肝癌研讨所，以研讨肝癌的原因、防备和医治。现在医治肝癌的办法许多，效果均不显着，尤其是晚期肝癌，生存期很难延伸。开发传统中草药用来抗癌是当今肿瘤防治的趋势之一。蟾蜍是指两栖纲蟾蜍科动物中华大蟾蜍，多产于江浙一带，以蟾蜍为来历的中药材有蟾酥、蟾皮、干蟾，首要药用效果有强心、解毒、止痛、增强免疫等。其自身就有必定毒性，食用过量会导致逝世。所以，古代中医就有“以毒攻毒”的说法，用它来医治恶性疾病。现在发现蟾蜍具有必定抗肿瘤的效果，启东肝癌研讨所出产的复方蟾龙片，海门的蟾衣研讨所出产的蟾衣制品，均为开发的蟾蜍产品，在临床抗肝癌医治中，都取得了必定的效果。金蟾胶囊是本院自行开发研发，以中华大蟾蜍的新鲜蟾皮为主药，配以其他十几味宝贵中药精制而成的中药复方制剂。本研讨仿制肝癌模型，施以金蟾胶囊医治，调查验证其抗肿瘤效果并评论其效果机制，为该复方中药的临床运用供给试验根据。
1材料与办法
1.1试验材料
BALB/C小鼠50只，均为雄性，体重20～25g，由南通大学医学动物试验中心供给，动物运用许可证号：SYXK（苏）2002—0022。瘤株选用HepA肝癌腹水瘤小白鼠，种鼠由中国科学院上海药物研讨所供给。
1.2仪器与试药
1.2.1仪器 流式细胞仪：美国guavaeasyCyte8体系；剖析天平：梅特勒-托利多-30型；净化台：姑苏净化设备公司SW-CJ-2F型。
1.2.2试药 金蟾胶囊：每粒含中药0.25g，由南通大学药学院加工制备，批号：20110408；试验前将胶囊内容物用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液调配成3种不同浓度的混悬液，备用。环磷酰胺（CTX）：无锡恒瑞制药股份有限公司出产，批号：110211，试验时用打针用蒸馏水溶解制造。
1.3办法
取出HepA肝癌腹水瘤小白鼠的腹水瘤，捣碎成溶液。汲取0.2mL用16号针尖腹腔接种到BALB/C小鼠的腹内，总共接种50只，第2天称重，随机分为5组。（1）模型对照组：10只小鼠，用0.5%CMC溶液灌胃，剂量为1mL/100g小白鼠体重；（2）阳性对照组：10只小鼠，腹腔打针CTX，剂量为2mg/100g体重；（3）金蟾小剂量组：10只小鼠，用金蟾胶囊混悬液灌胃，剂量为40mg/100g体重；（4）金蟾中剂量组：10只小鼠，用金蟾胶囊混悬液灌胃，剂量为80mg/100g体重；（5）金蟾大剂量组：10只小鼠，用复方金蟾胶囊混悬液灌胃，剂量为120mg/100g。各组依照上述要求给药，每天1次，接连10d，到第11天处死。
1.4调查目标
1.4.1抑瘤率和胸腺指数 剥离皮下瘤块，用滤纸吸洁净后称重，核算各组抑瘤率和胸腺指数。核算公式为胸腺指数=[胸腺质量（mg）/小鼠质量（g）]×10。抑瘤率=（对照组均匀瘤重－医治组均匀瘤重）/对照组均匀瘤重[1-2]。
1.4.2小鼠TNF-a浓度测定 在试验到第11天小鼠处死前，各组选用眼球摘取法取血1mL，放置于冰箱0℃保存，24h后，于1500r/min离15min，取上清液，用波长450nm酶联仪依序丈量光密度（OD值）后换算血清中TNF-α浓度[3-4]。
1.4.3金蟾胶囊对HepA肝癌腹水瘤细胞周期测定 各组小鼠处身后，当即翻开腹部，剥离腹部肿瘤安排，放入少量磷酸盐缓冲液，将肿瘤安排用手术剪剪至浆糊状，再用200目尼龙筛过滤。然后将滤液用缓冲液PBS冲刷3次，冲完后用600r/min的转速离心2min，除掉大的细胞碎片。每根试管中参加70%乙醇1mL，用于固定细胞，然后放置于低温冰箱-20℃冻存，24h后溶解，离心去除乙醇，再用缓冲液PBS冲刷2次。参加混合溶液1mL（含0.1%柠檬酸三钠、0.3%TritonX-100、RNA酶、0.002%、0.01%PI，用0.9%氯化钠溶液制造），10min后用200目尼龙筛过滤，取滤液上机检测细胞周期[5-7]。
1.5计算学处理
计算学处理选用Stata7.0计算软件进行剖析 各组材料以x±s标明，组间比较选用t查验，以P<0.05为差异有计算学含义。
2成果
2.1各组的抑瘤率和胸腺指数比较
试验成果标明，与模型对照组比较，复方金蟾胶囊各组小鼠均匀肿瘤安排的分量均有显着下降，其间，大剂量组与其他两组比较，对HepA肝癌腹水瘤有更显着的按捺效果（P<0.01），胸腺指数也显着增高（P<0.01），并跟着剂量的递加，抑瘤效果逐步增强，显现出有较好的量-效联系。见表1。
2.2血清TNF-α浓度的测定
与模型对照组之间比较，3个药物医治组的血清TNF-α浓度均显着下降（P<0.05）；而各医治组之间相互比较，差异无计算学含义（P>0.05）。详见表2。
2.3金蟾胶囊对瘤细胞分裂各期的影响
复方金蟾胶囊各剂量组均能进步肿瘤细胞G0～G1期份额，减小S期份额，进而促进瘤细胞凋亡，其效果强度的改动呈剂量依赖性。金蟾胶囊各组对肿瘤细胞G2～M期的影响不大。成果见表3。
3评论
复方金蟾胶囊是由蟾皮、东北虎骨草、藏雪莲、蝎子等宝贵中药精美提炼而成。为验证其临床抗癌效果，本研讨经过仿制移植HepA肝癌腹水瘤小鼠的树立模型，进行抗肿瘤试验研讨。成果标明，复方金蟾胶囊对HepA肝癌腹水瘤成长具有显着的按捺效果，并呈剂量依赖性，其可能在诱导细胞分解、促进细胞凋亡、按捺血管生成、改动肿瘤细胞相关基因的表达等方面发挥抗肿瘤的效果。
血清中的TNF-α能严重破坏细胞因子间正向的和谐效果，使细胞因子网络功用紊乱，形成血管渗漏、脂肪降解等病理损害。而在实体瘤小鼠体内的TNF-α会反常升高[8-12]。本试验成果标明：金蟾胶囊能显着下降HepA肝癌腹水瘤小鼠TNF-α浓度，添加小鼠胸腺分量及胸腺指数，关于TNF-α水平反常升高的HepA肝癌腹水瘤小鼠起到显着的按捺效果，并控制在一个低水平状况，阐明其是经过进步机体免疫效果来发挥其抗肿瘤效果的。
试验中运用流式细胞仪检测各组小鼠HepA肝癌腹水瘤的细胞周期各时相散布，发现在复方金蟾胶囊的药物效果下的小鼠肝癌H22细胞细胞周期时相发作改动，使细胞增殖周期受阻，诱导肿瘤细胞发作凋亡；其S期细胞百分比显着削减，差异极显着；标明复方金蟾胶囊能显着阻滞肝癌H22细胞由G1期进入S期，使其阻滞于G1/G0期，然后削减细胞在该期DNA的仿制和组成，进而到达按捺肿瘤细胞成长的意图。
总归，金蟾胶囊抗肿瘤效果切当，能够进一步研讨开发利用。
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（收稿日期：2012-09-13 本文修改：陈 俊）
