袁亚芳 潘稚芬
[摘要] 意图 了解嘉兴一院2016～2017年结核分枝杆菌耐药状况，并运用比较蛋白质组学研讨其可能存在的耐药机制，为耐药结核病的防控战略供给科学依据。 办法 对2016年1月～2017年6月嘉兴一院746株结核分枝杆菌进行培育及药敏试验剖析，选用双向电泳技能比较临床不同耐药菌株与灵敏菌株的全菌蛋白表达图谱，运用基质辅佐激光解吸及电离飞翔时间质谱仪进行质谱剖析，经过蛋白质数据库对差异表达蛋白质相应的基因进行序列剖析。 成果 746株结核分枝杆菌中总耐药率为18.50%（138/746），單耐药率为9.92%（74/746），耐多药率为4.42%（33/746），多耐药率为4.16%（31/746）。4种药物的耐药率由高究竟依次为异烟肼（INH，11.53%，86/746）、链霉素（Sm，10.86%，81/746）、利福平（RFP，5.36%，40/746）、乙胺丁醇（EMB，4.29%，32/746）。初治耐药率及复治耐药率分别为17.22%（115/668）、29.49%（23/78），复治耐药率高于初治（χ2=6.976，P<0.01）；从蛋白质组学功用剖析结核分枝杆菌可能存在的耐药机制，发现了21个耐药结核杆菌的差异表达蛋白，其间5个蛋白的检出率在耐药菌株中相对较高，质谱剖析取得清晰的肽质量指纹图谱，分别为Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c。 定论 嘉兴一院近2年结核分枝杆菌耐药率保持在较低水平，且发现Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c与其耐药机制密切相关。
[关键词] 结核分枝杆菌；耐药谱；比较蛋白质组学；耐药机制
[中图分类号] R52 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）07-0071-05
[Abstract] Objective To investigate the status of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis（Mtb） and drug resistance related proteins， providing the basis for drug-resistant MTB prevention and control. Methods A total of 746 Mtb strains between January 2016 and June 2017 were cultured and anti-tuber-colosis drug susceptibility tests， the drug resistance of 4 kinds of anti-tuberculosis drugs was analyzed. The proteins extracted from different clinical drug resistant Mtb strains and susceptible Mtb strains were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Protein spots remarkly increased in different clinical drug resistant Mtb strains were digested in gel by enzyme and the mass of generated peptides were measured by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry（MALdI-TOF-MS）. The date obtained from peptide mass fingerprinting were used in protein database search. These genes of all strains were sequenced. Results The total resistance rate was 18.50%（138/746）， multi-drug-resistant rate was 4.42%（33/746）， mono-drug-resistant rate was 9.92%（74/746）， poly-drug-resistant rate was 4.16%（31/746）. Drug resistance rates ranked from high to low as isoniazid（INH， 11.53%，86/746）， streptomycin（Sm， 10.86%，81/746）， rifampicin（RFP， 5.36%，40/746）， ethambutol（EMB， 4.29%， 32/746）. nitial drug resistance rate and acquired drug resistance rate was 17.22%（115/668） and 29.49%（23/78） respectively， and acquired drug resistance rate was higher than the initial drug resistance rate，there was a statistically significant difference（χ2=6.976，P<0.01）. In all protein spot differences， 5 protein spots were upregulated inisoniazid-resistant strains and identified as Rv0444c， Rv1446c， Rv3146， Rv3002c and Rv2159c by （MALdI-TOF-MS）. Conclusion Mycobacterium tuberculosis resistant rate remains at low levels in the First Hospital of Jiaxing nearly two years.5 protein spots（Rv0444c， Rv1446c， Rv3146， Rv3002c and Rv2159c） might be associated with drug resistance mechanism.
[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Drug-resistant spectrum； Comparative proteomics； Drug resistance mechanism
结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的一种缓慢盛行症。我国是国际上22个结核病高担负国家之一，耐药结核病的传达盛行是现在我国结核病疫情居高不下的重要原因，其呈现和延伸，严峻阻止了我国结核病防治作业的进程，已成为严峻的公共卫生和社会问题。
现有的结核医治技能现已无法应对国内外日益严峻的结核病疫情，环绕这一疾病的防备、前期确诊和医治等全面展开研讨，据此推进结核分枝杆菌免疫、致病、耐药机制等基础研讨的行进脚步，不仅是结防作业者的一致，也是我国作为国际耐药结核“特别引起警示的国家和区域”的实践需求，在这种状况下，剖析本院2016～2017年结核分枝杆菌的耐药状况，运用比较蛋白质组学技能了解结核分枝杆菌蛋白质结构及空间差异、相互效果与联络，进一步论述耐药分子机制显得尤为必要。
1 材料与办法
1.1 一般材料
1.1.1 查询目标 挑选2016年1月～2017年6月嘉兴市榜首医院痰结核分枝杆菌培育阳性的结核病患者746例。患者基本状况见表1。
1.1.2 菌株来历 培育阳性的菌株均在嘉兴市榜首医院结核病试验室统一做药敏试验，挑选其间经药敏试验判定的单耐异烟肼菌株（3株）、单耐利福平菌株（3株）和耐多药菌株（4株）（其间包含异烟肼+利福平、异烟肼+利福平+乙胺丁醇、异烟肼+利福平+链霉素、异烟肼+利福平+链霉素+乙胺丁醇）；结核分枝杆菌规范菌株H37Rv（由国家参比试验室供给）。
1.1.3 首要仪器 PowerPac 3000电泳仪，PROTEAN IEF Cell等电聚集电泳仪，PROTEAN Ⅱ Xi Cell笔直板电泳仪，Molecular Image Fx凝胶图画扫描仪，PDQuest6.0图画剖析软件，均为美国Bio-Rad公司产品。U-3000分光光度计为HITACHI公司产品，质谱剖析系统为美国Applied Biosystems公司的Voyager System 6192基质辅佐激光解吸/电离飞翔时间质谱（MALDI-TOF-MS）。
1.2 办法
1.2.1 临床耐药结核分枝杆菌药敏试验 （1）746株痰培育阳性的结核分枝杆菌均挑选异烟肼（0.l mg/L）、利福平（1.0 mg/L）、链霉素（1.0 mg/L）和乙胺丁醇（5.0 mg/L）4种常用抗结核药物进行体外药物灵敏试验，选用《耐药检测攻略》引荐的份额法，核算耐药百分比。（2）耐药分类：单耐药：结核分枝杆菌对一种抗结核药物耐药。多耐药：结核分枝杆菌对一种以上的抗结核药物耐药，但不一起包含异烟肼、利福平。耐多药：结核分枝杆菌对一种以上的抗结核药物至少一起包含异烟肼、利福平耐药。（3）药敏试验均选用已知参阅规范的结核灵敏株（H37Rv）作为质量操控对照。
1.2.2 临床耐药结核分枝杆菌的细菌学试验 运用扫描电镜、透射电镜剖析泛耐药菌株细胞形状、细胞壁形状改变
1.2.3 结核分枝杆菌培育及蛋白质组分别离 将菌株接种到添加了10%ADC（0.5%牛血清白蛋白，0.2%葡萄糖，140 mmol/L NaCl）和0.5%甘油的Middlebrook 7H9中，37℃恒温培育箱中静置培育15～20 d，菌体浓度为1×108～2×108或光密度（OD600）为0.8～1.0收取菌体。80℃水浴加热0.5 h以杀死细菌。超声破壁，取得细胞组份蛋白。
1.2.4 运用比较蛋白质组学办法剖析耐药结核分枝杆菌的差异表达蛋白 运用生物信息学理论和技能，归纳剖析取得的若干耐药结核杆菌和药物灵敏菌株之间的差异蛋白。蛋白质组学办法—双向电泳技能（2D-Electrophoresis）：榜首向：固相pH梯度等电聚集凝胶电泳（用克己的电泳上样缓冲液，17 cm的胶条，pH 4～7、3～10）。选用被迫水化，低电压胶内泡胀法。聚集完毕后，当即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。第二向：聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。制造12%的聚丙烯酰胺凝胶，将IPG胶条面朝上放在凝胶的长玻璃板上。开始时用低电流（5 mA/gel/17 cm）或低电压，待样品在彻底走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20～30 mA/gel/17 cm），溴酚蓝指示剂达究竟部边际时中止电泳。取出凝胶，并切角以作记号。
1.2.5 肽指纹图谱判定与剖析 蛋白凝胶银染后，凝胶用Molecular Image Fx激光图画扫描仪扫描，配比剖析选用PDQuest 6.0软件完结。
挑选差异蛋白质斑驳，加适量消化液（50 mmol/L NH4HCO3，5 mmol/L CaCl2，12.5 ng/μL Trypsin）消化，抽干，加0.5%TFA溶解。MALDI-TOF-MS肽指纹图谱剖析并判定PepIdent（www.expasy.org/tools/peptident.pl）。
1.3 统计学办法
选用SPSS 22.0统计学软件统计剖析数据。计量材料用（x±s）表明，计数材料以描述性统计剖析，对耐药率的比较选用χ2查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 耐药基本状况
746株結核分枝杆菌中，608例对4种抗结核药物悉数灵敏，占81.50%，138例患者耐药，整体耐药率为18.50%；其间单耐药74例，单耐药率为9.92%；耐多药33例，耐多药率为4.42%；多耐药31例，多耐药率为4.16%。4种药物的耐药率由高究竟依次为H 11.53%（86/746）、S 10.86%（81/746）、R 5.36%（40/746）、E 4.29%（32/746）。见表2。
2.2 耐药谱剖析
四种药物均有单耐药状况发作；耐多药有四种组合：HR、HRS、HRE、HRSE；多耐药有五种组合：HS、HE、RS、SE、HSE。单耐药以耐S最多，耐多药以耐HRSE最多，其次是HR，多耐药以耐HS最多。初治患者耐药顺位为S（10.78%，72/668）、H（10.03%，67/668）、R（14.07%，27/668）、E（3.89%，26/668），复治患者耐药顺位为H（24.36%，19/78）、R（16.67%，13/78）、S（11.54%，9/78）、E（7.69%，7/78）。见表3。
2.3 初复治患者耐药状况剖析
初治患者668例中耐药115例，初治总耐药率为17.22%；耐多药21例，初治耐多药率为3.14%。复治患者78例中耐药23例，复治总耐药率为29.49%；耐多药12例，复治耐多药率为15.38%。复治总耐药率高于初治总耐药率（χ2=6.976，P<0.01），复治耐多药率高于初治耐多药率（χ2=24.753，P<0.01）。
2.4 耐药结核分枝杆菌的比较蛋白质组学研讨成果
运用PDQuest6.0图画剖析软件对临床不同耐药形式菌株、全敏菌株及H37Rv菌株进行剖析，共发现21个差异表达蛋白点，经切开消化后，进行MALDI-TOF-MS检测，并依据试验办法中叙说的数据库查找办法对这些差异点进行判定（表4）。其间5个蛋白的检出率在耐药菌株中相对较高、质谱剖析取得清晰的肽质量指纹图谱，分别为Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c（封三图2、图3，表5）。
3 评论
本研讨746株结核分枝杆菌中，总耐药率为18.50%（138/746），耐多药率为4.42%（33/746），其间初治耐药率和复治耐药率分别为17.22%（115/668）、29.49%（23/78），初治耐多藥率和复治耐多药率分别为3.14%（21/668）、15.38%（12/78），耐单药顺位从高到低依次为INH（11.53%）、Sm（10.86%）、RFP（5.36%）、EMB（4.29%），与2010年全国第五次结核病盛行病学抽样查询成果比较（总耐药率为36.8%，初治耐药率为36.9%，复治耐药率35.9%，总耐多药率6.8%，初治耐多药率为5.4%，复治耐多药率为15.4%，耐药顺位为INH 28.6%、Sm 19.6%、RFP 8.9%、EMB 6.8%），耐药率略低于全国流调水平[1]。单耐药率为9.92%（74/746），耐多药率为4.42%（33/746），低于潘稚芬等[2]报导的嘉兴一院2004～2010年耐药监测成果（单耐药率为17.28%，耐多药率为27.84%）。究其原因是因为嘉兴市榜首医院自2013年以来展开了全球基金耐多药防控战略，其间包含一切涂阳肺结核患者前期结核分枝杆菌液体培育，GeneXpert、基因芯片等快速分子生物学检测技能的运用；确诊的耐药肺结核患者均给予免费医治，每一例患者医治计划均由市级专家组评论决定，依据患者实践病况，运用规范及个体化相结合的耐药结核医治计划，剂量依据药代动力学特征核算，严格执行2个月住院医治（静脉用药），6个月强化期（打针）医治，18个月稳固期医治；辅以医务人员全程督导，并恰当给予患者养分及交通补助，进步服药的依从性，以上办法使肺结核的治愈率到达85%以上，耐多药肺结核的治愈率也到达70%以上，本研讨成果阐明近四年嘉兴一院耐多药肺结核病防控战略取得了必定的成效。
运用比较蛋白质组学办法剖析耐药结核分枝杆菌的差异表达蛋白，发现差异表达的21个蛋白质点中，新增2个、缺失6个、8个上调表达、2个下调表达、3个反常表达。这些差异蛋白首要为中心代谢/呼吸效果蛋白、调理蛋白、细胞壁和细胞外排系统和PE/PPE成员相关蛋白及保存假定蛋白。质谱剖析后取得5个清晰的肽质量指纹图谱，分别为Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c。
Rv2629c编码的是一种保存假定蛋白，研讨发现，这种蛋白是结核分枝杆菌进入埋伏成长状况高表达标志蛋白，存在于细胞膜和细胞壁，与利福平耐药机制密切相关。耐药菌可以经过下降生活才能，进入埋伏状况来反抗外界的不良环境，或以这种进入埋伏状况的办法下降与药物的效果功率，然后下降或反抗抗生素对其的杀灭效果[3]。研讨发现结核分枝杆菌胞内成长72 h后，耐药株中Rv2629基因上调显着。还有动物试验发现[4]过表达Rv2629的细菌感染小鼠20 d后，其脏器存活数多于对照组。而小鼠肺泡结构被炎性浸出物浸透和炎性细胞滋润，肺泡壁充血增厚，有显着的肉芽肿构成。以上成果均阐明耐药菌株中过表达的Rv2629可能进步其存活率和致病性，与其耐药机制密切相关。进一步研讨[5]发现Rv2629蛋白可能归于药泵系统，该系统最常见的首要是易化超宗族（major facilitator superfamily，MFS）和ATP结合盒宗族（ATP-binding cassette，ABC），但详细归于哪一种类型及其所发挥的详细机制都需求进一步依据加以证明。
RshA是由Rv0444c表达的一种SigK操纵子按捺蛋白，该蛋白在临床耐多药菌株中表达下调，阐明Rv0444c可能是与耐药相关的基因。耐药结核杆菌经过RskA的下调表达，弱化了对SigK的负调控，导致MPT83抗原蛋白的上调表达，并经过光镜发现Rv0444c的过表达可导致菌落边际规整，折光性增强，细胞壁有增厚趋势，由此可估测增厚的胞壁减低了抗结核药物穿胞杀菌效果[6]，但是试验发现MPT83抗原蛋白的上调表达却不影响耐药菌成长。还有研讨[7]称该蛋白还可以介导细菌对阿米卡星、卷曲霉素耐药。
Rv1446c编码的opcA蛋白是一种膜蛋白，其功用可能是磷酸戊糖途径中辅佐葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的一种蛋白质。研讨发现Rv1446c参加耐异烟肼结核分枝杆菌耐药机制构成[8-10]。现在对该蛋白质的深入研讨罕见报导。Rv2159c编码的是一种保存假定蛋白，亦归于结核分枝杆菌膜蛋白，该蛋白在耐多药菌株和单耐异烟肼菌株中都呈下降趋势，可能会导致结核分枝杆菌对宿主的侵袭才能下降[11]。Rv3002c编码的是乙酰羟酸合成酶小亚基（ilvN），该蛋白存在于支链氨基酸代谢途径，ilvN仅在临床耐多药株中新增表达，为耐多药发作机制供给线索，并可能成为抗耐多药结核的药物规划靶标和可能的耐药检测规范[12-13]。Rv3146又叫做NADH-CoQ氧化还原酶B链（nuoB），其在双耐药菌株的菌体蛋白中表达反常，归于中心代谢和呼吸效果相关蛋白[14]。对nuoB蛋白的抗原表位剖析发现，其可在耐多药结核患者中激起较高水平的体液免疫反响，具有耐药结核血清学辨别确诊的才能[15]。
综上所述，嘉兴一院结核病患者整体耐药率略低于2010年全国流调水平，这得益于本区域有用的防控办法，但复治患者耐药率、耐多药率高于初治患者，且初复治耐药顺位不同，因而，在医治时应依据患者不同类型、药敏试验及本区域结核分枝杆菌耐药特色，拟定个体化的化疗计划[16-17]。别的，运用比较蛋白质组学的办法，找到了临床不同耐药菌株和灵敏株之间差异表达蛋白，但这些蛋白耐药机制仍需进一步的试验证明。上述蛋白是挑选新式药物和确诊抗原的焦点，本研讨为寻觅新的药物靶标以及挑选不同临床耐药形式菌株确诊抗原供给方向，并为往后本区域耐药结核科学防控战略供给科学依据。
[参阅文献]
[1] 王黎霞，成诗明，陈明亭.2010年全国第五次结核病盛行病学抽样查询报告[J].我国防痨杂志，2012，34（8）：485-508.
[2] 潘稚芬，高跃中，刘加良，等.嘉兴市全球基金耐多药肺结核防治战略剖析[J].我国现代医师，2016，54（7）：131-135.
[3] Zhang L，Xu W，Cui Z，et al.A novel method of identifying Mycobacterium tuberculosis Beijing Strains by Detecting SNPs in Rv0444c and Rv2629[J]. Curr Microbiol，2014，68（3）：381-386.
[4] Feuerriegel S，K？觟ser CU，Niemann S. Phylogenetic polymorphisms in antibiotic resistance genes of the Mycobacterium tuberculosis complex[J].J Antimicrob Chemother，2014，69（5）：1205-1210.
[5] Velayati A A，Abeel T，Shea T，et al.Populations of latent Mycobacterium tuberculosis lack a cell wall：Isolation，visualization，and whole-genome characterization[J].Int J Mycobacteriol， 2016，5（1）：66-73.
[6] Zhang L，Xu W，Cui Z，et al. A novel method of identifying Mycobacterium tuberculosis Beijing Strains by Detecting SNPs in Rv0444c and Rv2629[J]. Curr Microbiol，2014，68（3）：381-386.
[7] Jhingan GD，Kumari S，Jamwal SV，et al.Comparative proteomic analyses of avirulent， virulent，and clinical strains of Mycobacterium tuberculosis identify strain-specific patterns[J]. J Biol Chem，2016，291（27）：14257-14273.
[8] Schubert OT，Ludwig C，Kogadeeva M，et al.Absolute proteome composition and dynamics during dormancy and resuscitation of Mycobacterium tuberculosis[J].Cell host & microbe，2015，18（1）：96-108.
[9] Holyoake LV，Hunt S，Sanguinetti G，et al.CydDC-mediated reductant export in Escherichia coli controls the transcriptional wiring of energy metabolism and combats nitrosative stress[J]. Biochem J，2016，473（6）：693-701.
[10] Sharma D，Bisht D. An efficient and rapid method for enrichment of lipophilic proteins from Mycobacterium tuberculosis H37Rv for two-dimensional gel electrophoresis[J].Electrophoresis，2016，37（9）：1187-1190.
[11] Balhana RJC，Singla A，Sikder MH，et al.Global analyses of TetR family transcriptional regulators in mycobacteria indicates conservation across species and diversity in regulated functions[J].BMC Genomics，2015，16（1）：479.
[12] Xu G，Ni Z，Shi Y，et al.Screening essential genes of Mycobacterium tuberculosis with the pathway enrichment method[J]. Mol Biol Rep，2014，41（11）：7639-7644.
[13] Amorim Franco TM，Blanchard JS.Bacterial Branched-Chain Amino Acid Biosynthesis：Structures，Mechanisms， and Drugability[J]. Biochemistry，2017，56（44）：5849-5865.
[14] Williams KJ，Jenkins VA，Barton GR，et al.Deciphering the metabolic response of Mycobacterium tuberculosis to nitrogen stress[J]. Mol Microbiol，2015，97（6）：1142-1157.
[15] Kapoor N，Pawar S，Sirakova TD，et al. Human granuloma in vitro model，for TB dormancy and resuscitation[J]. PLoS One，2013，8（1）：e53657.
[16] 黃静静，熊昌富，王春雷，等.2013-2014年海南省初复治涂阳肺结核患者耐药监测成果剖析[J]. 我国防痨杂志，2017，39（1）：95-99.
[17] 李妍，王西娣，陈美玲，等.陕西区域6年间结核分枝杆菌耐药状况剖析[J].临床肺科杂志，2017，22（8）：1489-1492.
（收稿日期：2018-01-04）
