汪鑫 雷晓文 陈丹 刘斌
[摘要]意图 研讨丙泊酚對脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HUBECs）p38 MAPK/NF-κB信号通路活性的影响。办法 将体外培育的HUBECs随机分为4组：对照组（C组）：给予脂肪乳20 mg/L；LPS组（L组）：给予LPS 10 mg/L；丙泊酚组（P组）：给予丙泊酚20 mg/L；丙泊酚+LPS组（PL组）：给予丙泊酚20 mg/L、LPS 10 mg/L。在给予相应药物后1、2、3、6、12 h五个时刻点检测p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB含量改动。成果 予以给药1 h时，L组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为10.32±0.73、60.32±5.73，与C组比较表达明显添加（P<0.05）。予以给药2 h时，L组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为9.23±0.53、69.23±5.53，与C组比较，表达明显添加（P<0.05）；PL组的p-p38 MAPK灰度值为6.32±0.35，与L组比较，明显下降（P<0.05）。给药3 h时，L组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为11.13±0.23、71.13±5.23，与C组比较，表达明显添加（P<0.05）；PL组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为8.95±0.21、56.95±5.21，与L组比较，明显下降（P<0.05）。给药6 h时，L组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为12.16±0.20、73.16±4.20，与C组比较，表达明显添加（P<0.05）；PL组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为9.65±0.32、58.65±4.32，与L组比较，明显下降（P<0.05）。给药12 h时，L组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为18.19±0.31、91.19±6.31，与C组比较，表达明显添加（P<0.05），PL组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为12.65±0.12、63.36±5.12，与L组比较，明显下降（P<0.05）。定论 LPS影响HUBECs能引起p-p38 MAPK、NF-κB表达添加，予以丙泊酚后按捺此种添加，这可能是丙泊酚抗炎的效果机制之一。
[关键词]丙泊酚；人脐静脉内皮细胞；炎症
[中图分类号] R614.2+4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）3（c）-0004-04
[Abstract]Objective To study the influence of Propofol on the activity of p38，MAPK/NF-κ B signal pathway in human umbilical vein endothelial cells （HUBECs） induced by lipopolysaccharide （LPS）.Methods HUBECs cultured in vitro were randomly divided into the 4 groups：control group （group C） was given Intralipid 20 mg/L，LPS group （L group） was given LPS 10 mg/L，Propofol group （P group） was given Propofol 20 mg/L，Propofol+LPS group （PL group） was given Propofol 20 mg/L and LPS 10 mg/L.The change in the content of p38 MAPK，p-p38 MAPK and NF-κB were detected at five time points of 1，2，3，6，and 12 h.Results When administered 1 h，the gray value of p-p38 MAPK and NF-κB in group L was 10.32±0.73，60.32±5.73 respectively，which increased significantly compared with group C （P<0.05）.When administered 2 h，the gray value of p-p38 MAPK and NF-κB in group L was 9.23 ±0.53，69.23±5.53，which increased significantly compared with group C （P<0.05），and the gray value of PL group was 6.32±0.35，which was significantly lower than that of group L.Administration of 3 h，p-p38 MAPK，NF-κB gray value in group L was 11.13±0.23，71.13±5.23 respectively，which increased significantly compared with group C（P<0.05）.p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 8.95±0.21，56.95±5.21 respectively in group PL，which decreased significantly compared with group L （P<0.05）.Administration of 6 h，p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 12.16±0.20，73.16±4.20 respectively in group L，which increased significantly compared with group C （P<0.05）.p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 9.65±0.32，58.65±4.32 respectively in group PL，which decreased significantly compared with the L group （P<0.05）.Administration of 12 h，p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 18.19±0.31，91.19±6.31 respectively，which increased significantly compared with group C （P<0.05）.p-p38 MAPK，NF-κB gray value in group PL was 12.65±0.12，63.36±5.12 respectively，which decreased significantly compared with group L （P<0.05）.Conclusion LPS stimulating HUBECs can increase the expression of p-p38 MAPK and NF-κB，and inhibit this increase after Propofol injection may be one of the mechanisms of Propofol anti-inflammation.
[Key words]Propofol；Human umbilical vein endothelial cells；Inflammation
丙泊酚因起效快、效果时刻短、可控性好，现在已成为临床广泛运用的一线静脉麻醉药。丙泊酚除了具有冷静麻醉效果外，近年来研讨报导[1]丙泊酚能够抗氧化应激，下降安排代谢率，可能对缺血缺氧器官具有维护效应。1992年，O′Donnell等[2]报导，临床剂量范围内的丙泊酚在体外可按捺中性粒细胞的极化，而且此效果与丙泊酚剂量成正相关，自此以后丙泊酚与炎症反响的联系就逐步被学者们注重并注重。后续有许多研讨报导[3-5]，支撑丙泊酚的抗炎效果。有研讨标明[6]，丙泊酚能按捺丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活、相关炎症因子的开释、NO的出产和细胞结构通透性，可是丙泊酚抗炎效果的详细机制，现在仍不彻底清楚。本研讨选用体外细胞模型，调查丙泊酚对p38 MAPK磷酸化及NF-κB表达的影响，评论丙泊酚抗炎的效果机制。
1材料与办法
1.1首要试剂
RPMI 1640培育基（Gibco公司，美国）；肽牛血清FBS（Gibco公司，美国）；新生儿脐带 鼠抗磷酸化p38抗体（CST公司）；兔辣根过氧化物酶偶联二抗（CST；鼠抗p38抗体（CST公司）；鼠抗NF-κB抗体（CST公司）；脂肪乳（Sino-Swed Pharmaceutical Corp.Ltd.，我国）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Escherichia coli O11：B4，Sigma公司，美国）；化学发光液（Pierce公司，美国）。
1.2试验办法
1.2.1细胞培育 取新鲜人脐带约20 cm长，用预温的D-PBS缓冲液洗去残血，加0.25%的胰蛋白酶于37℃保温10 min，用小牛血清停止反响，并用D-PBS冲刷消化下来的内皮细胞，兼并停止液。于室温离心10 min，1000 r/min搜集细胞沉积，用M199细胞培育基悬浮，置于一次性塑料瓶或培育板，37℃，5%CO2，5～7 d可长成。
1.2.2分组处理 取16个6 cm皿处于对数生长期且状况杰出的细胞，依照随机办法进行分组。对照组（C组）：给予脂肪乳20 mg/L，LPS组（L组）：给予LPS 10 mg/L；丙泊酚组（P组）：给予丙泊酚20 mg/L；丙泊酚+LPS组（PL组）：一起给予丙泊酚20 mg/l及LPS 10 mg/L。37℃，5%CO2条件下培育 1、2、3、6、12 h后搜集细胞悬液，于800 r/min，5 min离心 ，离心半径9.5 cm，棄上清，细胞沉积中参加适量的细胞裂解液，冰上裂解 30 min，连续置于漩涡振动器振动 10 min，4℃离心机中2000 r/min，离心 15 min，离心半径13.5 cm取上清运用 Bradford法定量后置于-80℃冻存。
1.2.3 Western blot检测蛋白表达 取等量蛋白样品上样，以5%的浓缩胶及12%的别离胶行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS-PAGE），电泳完毕后，将凝胶上的蛋白转至巨细相同的多聚亚乙烯氧化物（PVDF）膜上。PVDF膜用含 5%脱脂奶粉的洗刷缓冲液 TBST（pH=7.4，TBS中参加 0.1%Tween-20）关闭1 h后，运用TBST缓冲液漂洗3次，把膜放入含有抗 P-p38MAPK（1∶1000）或抗 p-ERK1/2（1∶1000）或抗NF-κB（1∶1000）的一抗稀释液（TBST中加5%胎牛血清）中常温孵育1 h后，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次后，用辣根过氧化物酶耦联的二抗（1∶2000）室温下孵育1 h。TBST缓冲液漂洗3次，然后与化学发光液反响1 min，避光显色，参加TBS停止反响。在Kadak digital science ID多功用图画工作站收集成果，剖析膜上蛋白条带灰度值。
1.3调查目标
各组在给予相应药物后1、2、3、6、12 h五个时刻点检测p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB含量改动。
1.4统计学处理
选用SPSS 13.0统计学软件进行剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）表明，组间比较选用单因素方差剖析，组内比较选用t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1 各组不一起刻点p-p38 MAPK表达的比较
与C组比较，L组和PL组在给药后各个时刻点的p-p38 MAPK表达添加，PL组较L组下降（P<0.05），P组和C组比较，差异无统计学含义（P>0.05）（表1）。
2.2各组不一起刻点内皮细胞核NF-κB蛋白表达的比较
与C组比较， L组和PL组在给药后各个时刻点的NF-κB蛋白表达添加，PL组较L组添加（P<0.05）（表2）。
3 评论
血管内皮细胞是人体内重要的效应细胞，其结构和功用的改动在感染性休克、ARDS等的发病过程中起重要效果，也是内毒素等常见的靶细胞[7-8]，一起人脐带静脉内皮细胞来历广泛，因而本研讨选取人脐静脉内皮细胞作为研讨目标。
LPS是革兰阴性细菌细胞壁的一种成分，其从细菌内开释出来后构成内毒素，可介导严峻感染，感染性休克，多器官功用障碍等[9]。有研讨报导[10]，经过LPS介导的信号转导通路能为临床医治内毒素性休克、全身炎症反响综合征供给新的医治思路。
MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能够介导细胞对体表里各种应激的信号反响[11]，p38MAPK是其间一条重要的组成部分。LPS是炎症反响重要的发动因子[12]，它能够激活MAPK宗族，使相应蛋白磷酸化而介导炎症反响[13]。
臨床上许多需全身麻醉的手术患者或重症监护室的患者存在全身感染的状况，丙泊酚作为手术室广泛应用的静脉全身麻醉药及ICU冷静药[14-15]，因其具有抗炎效果逐步遭到人们的注重[16-19]。但丙泊酚抗炎效果的详细机制仍不十分明确，因而，本研讨以血管内皮细胞为目标，研讨丙泊酚在LPS诱导的炎症反响中与MAPK宗族磷酸化的联系。
p38MAPK开始被Han等[20]作为一种LPS影响巨噬细胞中的酪氨酸磷酸化蛋白而判定出来。本研讨成果显现，与L组比较，PL组各个时刻点p-p38MAPK磷酸化水平明显下降，提示丙泊酚按捺炎症反响的效果可能与按捺p38MAPK磷酸化有关。一起，本研讨成果显现，与L组比较，PL组在各个时刻点的NF-κB蛋白表达含量减低，提示丙泊酚可能经过按捺p38MAPK磷酸化及NF-κB蛋白表达来按捺炎症反响。
综上所述，丙泊酚能够按捺人脐静脉血管内皮细胞遭到LPS影响后p38MAPK磷酸化水平增高，按捺NF-κB蛋白表达，这可能为丙泊酚按捺炎症反响的效果机制之一。可是丙泊酚是否经过改动其他蛋白质的表达，来按捺MAPK蛋白磷酸化和NF-κB蛋白表达仍需进一步研讨。
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