陈江涛 李健 潘雪峰
[摘要]意图 研讨赤道几内亚比奥科岛（Bioko Island）恶性疟原虫别离株裂殖子外表蛋白1（PfMSP-1）基因和裂殖子外表蛋白2（PfMSP-2）基因分型。办法 从比奥科岛收集疟疾患者血样181份，用显微镜法和荧光定量PCR判定虫种。选用巢式PCR别离扩增PfMSP-1和PfMSP-2中具有型特异性的片段，进行等位基因分型。成果 PfMSP-1基因分型：181份恶性疟患者血样中有178份扩增出PfMSP-1基因片段（98.34%），其间K1、MAD20和RO33基因型片段别离为171份（94.48%）、175份（96.69%）和126份（69.61%）。混合感染率为97.24%；PfMSP-2基因分型：181份血样中有173份PfMSP-2基因片段（95.58%），其间48份（26.52%）独自扩增到3D7型基因片段，4份（2.21%）独自扩增到FC27 型基因片段，混合感染率为66.85%。定论 赤道几内亚比奥科岛PfMSP-1和PfMSP-2等位基因型散布规模极广。混合感染是比奥科岛疟疾的首要类型。
[关键词]恶性疟原虫；裂殖子外表蛋白1；裂殖子外表蛋白2；比奥科岛
[中图分类号] R382.3+1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）05（a）-0009-04
[Abstract]Objective To study the type of Plasmodium falciparum MSP-1 （PfMSP-1） and PfMSP-2 gene in Bioko Island of Equatorial Guinea.Methods 181 blood samples were collected from patients with malaria in Bioko Island.Microscopy and fluorescence quantitative PCR were used to identify the insect species.Nested PCR was used to amplify the specific fragment of PfMSP-1 and PfMSP-2 respectively，then the allele typing was conducted.Results PfMSP-1 genotypes：178 （98.34%） PfMSP-1 gene fragments were amplified from the 181 blood samples.MAD20-type，K1-type and RO33-type alleles were obtained from 171 （94.48%），175 （96.69%） and 126 （69.61%） samples respectively.The mixed infection rate was 97.24%.PfMSP-2 genotypes：173 （95.58%） PfMSP-2 gene fragments were amplified from the 181 blood samples of patients.Single 3D7-type and single FC27-type alleles were obtained in 8 （26.52%） and 4 （2.21%） samples respectively.The mixed infection rate was 66.85%.Conclusion PfMSP-1 and PfMSP-2 from Bioko Island are widespread.Mixed infection is the main type of malaria in Bioko Island.
[Key words]Plasmodium falciparum；Merozoite surface protein-1；Merozoite surface protein-2；Bioko Island
瘧疾是严峻危害人类健康和影响经济发展的虫媒盛行症，在热带、亚热带以及温带部分区域广泛盛行。疟疾首要散布于非洲的撒哈拉沙漠以南区域、东南亚以及加勒比海区域[1]。全世界每年约有2亿疟疾新发病例，导致约50万人逝世。非州中部的赤道几内亚共和国是全球疟疾感染最为严峻的区域之一，该国绝大多数的疟疾病例是由恶性原虫感染导致的[2]。近五年来，虽然赤道几内亚的卫生部门施行了强有力的疟疾防控方案，但该区域的疟疾患病率依然居高不下[3]。疟原虫的基因多态性是形成该区域防控办法发展缓慢的首要妨碍之一[3]，因而，迫切需要咱们去了解恶性疟原虫的临床别离株的基因多样性。
恶性疟原虫裂殖子外表蛋白1（PfMSP-1）和2（PfMSP-2）是疟原虫裂殖子外表蛋白宗族中的两个重要成员[4]，一起也是疟原虫裂殖子外表的两个非常重要的抗原，在疟原虫裂殖子侵袭红细胞时发挥重要的作用[5]，并能诱导宿主发生免疫应对反响，并被认为是极有期望发展出无性红内期重要的候选疫苗的组分[5-6]，因而用PfMSP-1和PfMSP-2作为分子符号，在疟疾分子盛行病学研讨上具有重要价值。一直以来，世界各地研讨人员对PfMSP-1和PfMSP-2的基因多态性做了许多研讨[5，7-8]，但现在未见任何关于赤道几内亚恶性疟原虫种群的MSP1和MSP2基因做了分型研讨，为了解该岛恶性疟原虫虫株的基因类型和疟疾的分子盛行病学研讨和针对性的疫苗制备供给科学依据。
1资料与办法
1.1血液样本
2011年1月～2014年12月，从赤道几内亚比奥科岛不同区域就诊于马拉博区域医院和区域确诊性诊所的患者中一共收集了181份恶性疟原虫感染血液样本。该研讨得到马拉博区域医院（Malabo Regional Hospital）道德委员会赞同，一起获得每例患者的知情赞同。
1.2 疟原虫的辨别和虫密度核算
选用WHO引荐的白细胞疟原虫计数法，在油镜下对吉姆沙染色后血涂片进行镜检。依照本实验室以往树立定量PCR及熔解曲线的办法进行虫种判定[9]，一起以四种疟原虫（间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫）的质粒为参照物。
1.3基因组DNA（gDNA）的提取
寄生虫的gDNA由运用Chelex-100提取办法[9]。用打孔器取直径5 mm干血斑，置于1.5 ml离心管，先参加l ml的无菌水浸泡2 h，然后16 000 r/min，离心5 min，弃上清；再加160 μl的5% 的Chelex-100混悬液，56℃加热2 h，95℃变性8 min，振动30 s，16 000 r/min，离心5 min，汲取上清，-20℃保存备用。
1.4 PfMSP-1和PfMSP-2基因的分型
依照PlasmoDB（http：//plasmodb.org），基因ID为PF3D7_0930300 and PF3D7_0206800的PfMSP-1和PfMSP-2序列组成各自的巢式PCR引物（表1）[10]。依据PfMSP-1基因2、3区重复序列数量和毗邻序列类型的差异，可分为K1，RO33，MAD20三个基因型；依据PfMSP-2基因3区的部分片段，可分为3D7和FC27两个基因型。首要运用共用外部引物进行PCR扩增，接下来运用匹配于PfMSP-1三个基因型和PfMSP-2两个基因型的特异性引物别离进行扩增。第1次扩增反响用2 μl上述制备的DNA 作模板，第2次扩增反响用2 μl 第1次的反响产品作模板，其反响体系整体积为50 μl，其间含DNA模板2 μl，20 pmol/μl上下游引物各1 μl，1 μl的Taq聚合酶（东盛生物技术公司，广州）、10×Buffer（Mg2+Plus）5 μl、dNTP Mixture（各2.5 nm）4 μl、水36 μl；在伯乐Mini MJ PCR仪上进行实验，PCR反响条件如下：95℃变性3 min，93℃ 30 s-52℃ 30 s-72 ℃延伸 1 min（35个循环）；72℃延伸5 min。反响完毕后，取10 μl PCR产品于2%琼脂糖电泳和EB染色后，用紫外分析仪调查成果并摄影。PCR产品的巨细依据25～700 bp的DNA Marker（东盛生物技术公司，广州）进行预算，PCR产品之间长度≥20 bp划分为不同基因类别。
2 成果
2.1 PfMSP-1基因分型成果
181份恶性疟疾患者的血样经巢式PCR扩增PfMSP-1基因片段，阳性成果178份（98.34%）（表2），其间K1等位株171份（94.48%），基因片段在100～320 bp，以120～200 bp的基因片段占优势位置；MAD20等位基因型175份（96.69%），基因片段在100～280 bp，以120～180 bp的等位基因片段占优势位置；RO33等位基因型126份（69.61%），基因片段在140～520 bp，以140～160 bp的基因片段占优势位置。由此可见，K1和MAD20基因型虫株为比奥科岛的优势虫株。从表可见，大多数患者为多基因型虫株混合感染，混合感染率为97.24%。仅有1.10% （2/181）的样本为独自MAD20基因型虫株感染，未发现独自感染K1和RO33的等位基因型虫株的样本。
2.2 PfMSP-2基因分型成果
181份的血樣恶性疟疾患者的血样中的173份用上述等位基因特异性引物经巢式PCR扩增得到PfMSP-2基因片段（表2），归于独自3D7等位基因型感染48份（26.52%）， 片段长度在200～330 bp，独自FC27等位基因型感染4份（2.21%），基因片段长度在330～500 bp。可见3D7型虫株为该岛优势虫株。其他121份血样一起扩增出两种不同等位基因型的基因片段， 混合感染率为66.85 %。
3 评论
某一区域恶性疟原虫种株的基因分型及变异程度与患者的年纪、遗传特性有必定的联系，也与疟疾疫苗的作用点评密切相关[4]，因而，恶性疟原虫的基因分型是近年来国际上的研讨热门。PfMSP-1和PfMSP-2作为疟原虫裂殖子外表蛋白宗族中的两个重要成员，参加疟原虫裂殖子侵略红细胞的进程， 一起能诱导宿主发生免疫应对效应，因而，对其进行分型研讨具有重要意义。
本研讨经过对中非区域赤道几内亚共和国的比奥科岛恶性疟原虫的种群进行MSP-1和MSP-2基因的分型研讨，成果表明比奥科岛恶性疟原虫种群别离有26种MSP-1和42种MSP-2的等位基因型存在。这显着高于其间非邦邻的报导，如Aubouy等[10]报导的加蓬存在25种PfMSP-1等位基因型和19种PfMSP-2等位基因型；Mayengue 等[11]报导刚果存在15种PfMSP-1等位基因型和20种PfMSP-2等位基因型；Dolmazon等[12]报导的中非共和国（CAR）的17种PfMSP-1等位基因型和25种PfMSP-2等位基因型。
比奥科岛的恶性疟原虫种群的MSP-2基因存在两种类型，即3D7等位基因型和FC27等位基因型，它们别离扩增出22和20种基因片段。与其他中非邦邻比较，3D7等位基因型在加蓬报导了8种[10]，刚果共和国的布拉柴维尔发现了10种[11]，在中非的班基发现了11种[12]。FC27等位基因别离在加蓬[10]、刚果共和国的布拉柴维尔[11]、中非的班基[12]发现了11、10、11种，因而，赤道几内亚的PfMSP-2的多态性显着高于其他的中非国家；本研讨亦发现比奥科岛恶性疟原虫种群的MSP-1的K1、MAD20和RO33基因别离有9、9和8个基因片段，K1和MAD20等位基因宗族是首要的基因型，与中非的加蓬[10，13]、尼日利亚[14]、喀麦隆[15]的研讨共同。
以往的疟原虫遗传多态性研讨发现，全球许多区域存在很大份额的多种恶性疟原虫株、型盛行，而同一区域的恶性疟原虫基因多样性及多重感染的盛行程度与当地疟疾的盛行水平密切相关[4]，比如该区域的传播媒介的种群结构、人类宿主、昆虫接种率以及对立疟药敏理性等的差异，在必定程度上对恶性疟原虫种群结构都发生了巨大影响。本研讨发现了，伴随着当地PfMSP-1和PfMSP-2各等位基因的高度杂乱多样性，多重感染的份额也适当之高，这个发现与以往在伊朗的报导共同[16]。该岛恶性疟原虫的PfMSP-1等位基因型的混合感染率高达97.24%，PfMSP-2等位基因型的混合感染率也高达66.85 %，提示在当地树立全面监测耐药性的基础上体系地探求疟原虫种群的盛行病学特征，对拟定该区域疟疾防备和杀灭对策是至关重要的。一起也提醒了咱们，在疟原虫分子盛行病学的研讨中只用一种分子符号得出的成果并不是很牢靠的，研讨中一起运用两种以上的分子符号可获得愈加有用和精确的信息。
[参考文献]
[1]陈江涛，林敏，刘配芬，等.G6PD缺点症对恶性疟疾感染危险的影响[J].有用医学杂志，2014，21（7）：3418-3421.
[2]Lin M，Yang LY，Xie DD，et al.G6PD deficiency and hemoglobinopathies：molecular epidemiological characteristics and healthy effects on malaria endemic Bioko Island，Equatorial Guinea[J].PLoS One，2015，10（4）：e0123991.
[3]Rehman AM，Mann AG，Schwabe C，et al.Five years of malaria control in the continental region，Equatorial Guinea[J].Malar J，2013，12（2）：154.
[4]張苍林，杨亚明，潘卫庆.恶性疟原虫裂殖子外表蛋白等位基因分型研讨发展[J].我国病原生物学杂志，2015，10（4）：373-376.
[5]卢义钦，刘俊凡.侵略疟原虫与红细胞膜的相互作用[J].生命的化学，2006，26（6）：532-535.
[6]Moorthy V，Hill AV.Malaria vaccines[J].Br Med Bull，2002， 62（14）：59-72.
[7]Kolawole OM，Mokuolu OA，Olukosi YA，et al.Population genomics diversity of Plasmodium falciparum in malaria patients attending Okelele Health Centre，Okelele，Ilorin，Kwara State，Nigeria[J].Afr Health Sci，2016，16（3）：704-711.
[8]Pattaradilokrat S，Sawaswong V，Simpalipan P，et al.Genetic diversity of the merozoite surface protein-3 gene in Plasmodium falciparum populations in Thailand[J].Malar J，2016， 15（1）：517.
[9]陈江涛，刘配芬，钟德善，等.SYBRGreenI染料法定量PCR检测疟原虫感染及辨别虫种的临床运用[J].分子确诊与医治杂志，2013，5（4）：227-230.
[10]Aubouy A，Migot-Nabias F，Deloron P.Polymorphism in two merozoite surface proteins of Plasmodium falciparum isolates from Gabon[J].Malar J，2003，2（7）：12.
[11]Mayengue PI，Ndounga M，Malonga FV，et al.Genetic polymorphism of merozoite surface protein-1 and merozoite surface protein-2 in Plasmodium falciparum isolates from Brazzaville，Republic of Congo[J].Malar J，2011，10（7）：276.
[12]Dolmazon V，Matsika-Claquin MD，Manirakiza A，et al.Genetic diversity and genotype multiplicity of Plasmodium falciparum infections in symptomatic individuals living in Bangui （CAR）[J].Acta Trop，2008，107（1）：37-42.
[13]Bouyou-Akotet MK，M′Bondoukwé NP，Mawili-Mboumba DP.Genetic polymorphism of merozoite surface protein-1 in Plasmodium falciparum isolates from patients with mild to severe malaria in Libreville，Gabon[J].Parasite，2015，22（7）：12.
[14]Olasehinde GI，Yah CS，Singh R，et al.Genetic diversity of Plasmodium falciparum field isolates from south western Nigeria[J].Afr Health Sci，2012，12（3）：355-361.
[15]Wanji S，Kengne-Ouafo AJ，Eyong EE，et al.Genetic diversity of Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 block 2 in sites of contrasting altitudes and malaria endemicities in the Mount Cameroon region[J].Am J Trop Med Hyg，2012，86（5）：764-774.
[16]Zakeri S，Bereczky S，Naimi P，et al.Multiple genotypes of the merozoite surface proteins 1 and 2 in Plasmodium falciparum infections in a hypoendemic area in Iran[J].Trop Med Int Health，2005，10（10）：1060-1064.
（收稿日期：2017-04-14 本文修改：许俊琴）
