周世娟
[摘要]意图 评论怎么判定阳性血培育瓶里“失踪”的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）。办法 选用靶向DNA测序（16S rRNA基因扩增）的办法终究判定出“失踪”的细菌。成果 “失踪”的细菌被判定为肺炎链球菌。定论 根据靶向DNA测序（16S rRNA基因扩增）判定可及时、精确判定出因自溶逝世的肺炎链球菌，启示微生物查验程序中血培育报阳后应当即涂片、转种平板，并结合血培育成长曲线、涂片染色成果作进一步的剖析等，以进步血培育的阳性检出率，有利于削减漏报及误报的发作。
[要害词]16S rRNA；测序；肺炎链球菌；自溶
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）01（c）-0126-03
[Abstract] Objective To explore how to identify the disappeared Streptococcus pneumoniae in positive blood culture flask.Methods By targeted DNA sequencing （16S rRNA gene amplification），the disappeared bacterium was finally identified.Results The disappeared bacterium was identified as Streptococcus pneumoniae.Conclusion By targeted DNA sequencing （16S rRNA gene amplification） identification can detect the Streptococcus pneumoniae dead due to autolysis.It is indicated that in the process of bacteriological examination，smear and transmission to plate combined with growth curve and smear results of blood culture are performed right away after blood culture being positive.Together with growth curve of blood culture and outcomes of smear staining，further analysis is needed in order to increase positive detection rate of blood culture and reduce occurrence of report in fail and mistake.
[Key words]16S rRNA；Sequencing；Streptococcus pneumoniae；Autolysis
血流感染（blood stream infection，BSI）是一种严峻的全身感染性疾病，包含菌血症和败血症，是致病菌或条件致病菌侵入血液中成长繁衍并开释毒素和代谢产品而引起的急性重症感染性疾病，其发病率和致死率都较高[1]。全球每年约发作200 000例BSI，病死率为20%～50%，是最严峻的感染性疾病之一[2]。美国每年约有750 000例患者患血源性感染，导致215 000例逝世，是美国第十大死因，占总逝世人数的6%[3-4]。在儿童患者中，革兰阳性菌引起的BSI病毒死率达19.2%，革兰阴性菌引起的BSI病死率为45.2%，真菌菌血症则为35.8%。在医院感染中，BSI占15%，不只延伸了患者的住院时刻，还增加了患者的经济负担[2]。
血培育是临床判别患者BSI的最重要根据[1]。所以试验室对阳性血培育瓶别离判定出病原菌，对临床感染性疾病的确诊起了决定性的效果。现在血培育病原菌的判定首要依靠转种别离得到纯菌后，才可进一步做细菌的判定。关于一些苛养菌、固体培育基不成长细菌的判定就比较困难，进步警觉，以防漏报、误报。现将本室在血培育检测工作中的1例阳性血培育瓶中细菌的奥秘“失踪”后的曲折判定进程报导如下。
1材料与办法
1.1一般材料
2016年4月，患者男，65岁，肿瘤科新入院肺癌患者，不规则发热1周余，偶有咳嗽、喘憋、呼吸增快、呼吸困难等，入院查体，体温38.3℃，血常规：WBC 20.46×109/L，中性粒细胞百分比96.7%，C-反响蛋白58.96 mg/L，降鈣素原9.66 mg/ml，抽取单瓶血需氧培育送微生物室做查看（本微生物室没有展开厌氧培育）。
1.2检测用仪器、试剂
仪器：Versa TREK-96全自动血培育仪（美国TREK公司）；Olympus CX21显微镜（奥林巴斯公司）；CO2培育箱WJ-Ⅲ-50B型（上海跃进医疗器械有限公司）；一般培育箱WS2-134-65型（上海跃进医疗器械有限公司）；3730XL测序仪（ABI公司）等。
试剂：血平板（广州迪景微生物科技有限公司）、巧克力平板、麦康凯平板（法国梅里埃）等；快速革兰染液、抗酸染液（珠海贝索公司）、瑞氏染液（杭州天和微生物试剂有限公司）；需氧血培育瓶（美国TREK公司配套）；肺炎链球菌抗原检测试剂（美国Binax NOW公司）。
1.3质量操控
革兰染色选用省临检中心供给的质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922规范菌株别离做阳性、阴性质控对照，其他项目室内质控都在控。
1.4接纳标本后判定流程
简易流程见图1。
第1天：标本收集与培育办法参照《血培育检测规范化操作》[5]进行标本的正确收集并将其快速置于全自动血培育仪中进行接连振动培育和监测，未见阳性报警。
第2天：早上8：00上班时将阳性报警瓶（曲线典型）卸出，见瓶内上清呈细微混浊，后无菌操作抽取培育液转种血平板、巧克力平板（35℃，5%CO2孵箱）、麦康凯平板（35℃孵箱），阳性瓶内容物涂片一起进行革兰染色镜检为革兰阴性成对摆放球菌（图2）。
第3天：转种培育后的血平板、巧克力平板、麦康凯平板均无菌成长；从头将报警阳性瓶内容物涂片进行革兰染色、抗酸染色、瑞氏染色后均无菌，前1 d涂片看见的G-成双摆放球菌却奥秘“失踪”了，重抽取阳性报警瓶（瓶内上清变弄清）中原始培育物注入新的血培育瓶（传代培育瓶）上全自动血培育仪持续监测培育，再将原阳性报警瓶从头转种培育至血平板、巧克力平板、麦康凯平板。原阳性培育液瓶上清弄清，仅见管底留有少量米黄色沉积。另取出肺炎链球菌抗原检测板，抽取阳性报警瓶中原始培育物2 ml，离心取上清，用配套的Binax棉签蘸取上清标本加入到试剂模孔内，往孔内滴入3滴试剂A，停止15 min后读取成果为阳性。“失踪”菌疑为肺炎链球菌因“自溶”而逝世消失概率大，遂立行将原阳性血培育瓶上送广州金域查验中心进行靶向DNA测序判定。
第4天后：传代培育瓶监测培育期间未见阳性报警，卸下瓶内弄清，未见沉积，涂片镜检未见细菌；从头转种培育后的血平板、巧克力平板、麦康凯平板仍无菌成长。
2成果
该原阳性血培育瓶第2天涂片“稍纵即逝”见“影”——G-成对摆放球菌后，第3天后就“无影无踪”，遂加做阳性报警瓶中原始培育物肺链抗原检测为阳性（方针锁定为肺炎链球菌弛缓症链球菌）[6]，并将有少量米黄色沉积的原阳性报警瓶上送广州金域查验中心做基因测序，有用序列经剖析显现与肺炎链球菌的类似度为100%。由此水落石出：阳性血培育瓶“失踪”菌为肺炎链球菌，因“自溶”使菌体从“有影”到“无踪”。
回忆性查看全自动血培育仪中该阳性血培育瓶的初报阳时刻为接纳标本次日清晨1：30报警，但因条件所限（本室晚上无夜班轮岗）没及时转种，次日8：00（间隔初报阳>6.5 h）上班搭档才处理阳性血培育瓶，涂片可见G-成对摆放球菌，而第3天转种未见细菌成长及原阳瓶重涂片细菌却“失踪”了，传代培育瓶进行接连监测培育，未见阳性报警，种种痕迹契合蔡婷婷等[7]的报导成果：肺炎链球菌阳性报警后6 h为革兰阴性球杆菌，在阳性报警后可在8～10 h内自溶逝世。我室在阳性报警6.5 h后方进行转种、涂片染色等处理，错失最佳处理时刻。
3评论
1881年肺炎链球菌初次由巴斯德（Louis Pasteur）及G.M.Sternberg别离在法国及美国从患者痰液中别离出。肺炎链球菌常定植于人体呼吸道，尤以鼻咽部最常见，罗小铭等[8]报导中山区域正常人群鼻咽部肺炎链球菌带着率为26.6%，少年儿童鼻咽部带着率较成人高。由此可见呼吸道黏膜对肺炎链球菌存在很强的天然抵抗力。跟着各种血液留置导管的介入，临床抗菌药物的广泛应用和很多免疫受损宿主的呈现，各种原因使机体抵抗力下降时易发作侵袭性肺炎链球菌疾病，包含菌血症、败血症、脑膜炎、脓胸、骨髓炎等[9]。在化脓性球菌中，肺炎链球菌的致病力仅次于金黄色葡萄球菌。刘德华等[1]报导从2013～2014年全国细菌耐药监测网云南区域28家三级医院的14 519株血培育阳性菌株中肺炎链球菌110株，构成比占0.76%。本病例为肺癌患者，机体抵抗力低下，易受侵袭。
肺炎链球菌属链球菌科，链球菌属。肺炎链球菌是革兰阳性菌，肺炎链球菌菌体为革兰阳性，呈矛头状，多成双摆放（故亦称为肺炎双球菌），宽端相对，顶级相背，有较厚荚膜（有毒株在体内构成荚膜：一般染色时荚膜不上色，表现为菌体周围通明环），无鞭毛，不构成芽胞。当菌体变老时，或因为自溶酶的发作将细菌裂解后，可呈现革兰染色阴性[2]。本菌为苛养菌，养分要求较高，需在含血液或血清的培育基中成长。在固体培育基上构成小圆形、拱起、外表润滑、湿润的草绿色菌落。培育初期菌落拱起呈穹隆形，跟着培育时刻的延伸，细菌发作的自溶酶裂解细菌，使菌落中心洼陷，边际拱起呈“脐窝状”或火山口状。在血清肉汤中培育稍久亦因细菌自溶而使混浊的培育液突变弄清[10]。
肺炎链球菌自身存在自溶的特性，首要原因是其自溶素（细胞壁水解酶，autolysin of S.pn，LytA）经过裂解-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸，导致细胞壁肽聚糖骨架开裂，使细胞壁崩塌，终究导致细胞溶解逝世[11]，进程中会引起菌体革兰染色特性的改动（G+→G-），见图2。肺炎链球菌当成长进入稳定时后会当即引起溶菌[12]，表现在培育24 h左右使血平板菌落中心陷落呈脐窝状，在液体培育基跟着培育时刻的延伸溶解逝世而使培育基弄清，仅见管底留有少量沉积。蔡婷婷等[7]研讨肺炎链球菌在阳性血培育瓶报警后6 h革兰染色镜检为G-球杆，并在8～10 h内自溶逝世。所以及时转种阳性血培育瓶是削减肺炎链球菌漏检的要害。
曾经，肺炎链球菌的判定只能依靠对别离的活菌选用传统办法：菌落形状（自溶现象、脐窝状菌落、广大草绿色溶血环）、革蘭染色特征（G+，菌体呈矛头状，多呈双摆放，宽端相对，顶级相背，有较厚荚膜）及奥普托欣灵敏试验、菊糖阳性试验、血清学试验和胆盐溶菌试验等[13-14]进行判定。跟着医学查验技能的飞速发展，判定此菌查验办法也一日千里，如自动化细菌判定仪、肺炎链球菌抗原试验、乳胶凝聚试验、分子生物学检测（质谱技能及基因测序）等。本菌当面对转种后无活菌成长时，用传统办法判定已不可能，只能挑选免疫剖析及遗传学办法弥补判定。Petti等[6]关于阳性血培育瓶中的疑似肺炎链球菌标本，选用免疫层析试条检测肺炎链球菌抗原发现缓症链球菌与肺炎链球菌有穿插反响，特异性不行强。因而，终究挑选遗传学——分子生物学的确诊办法[2]，如靶向DNA测序（16S rRNA基因扩增）判定。细菌16S rRNA的相对分子量巨细适中，约1500 bp，合适序列剖析，又因其含有对一切细菌种及可变区的广泛区段[15]。因而16S rRNA基因成为细菌体系分类判定的抱负靶序列，也广泛被细菌学家和分类学家承受和运用。在DNA序列剖析中，16S rRNA最常用于判定细菌的种，判定快速、简洁、特异性好，是现在对在临床苛养菌以及固体培育基不成长细菌进行判定、检测和新菌种发现方面最牢靠的办法之一[2]。
综上所述，血培育是当时BSI病原学确诊的“金规范”，经过对本院1例血培育中肺炎链球菌自溶现象的论述，启示在微生物查验进程序中经常会呈现一些假阳性及假阴性成果，各试验室应树立一个有用的削减漏报及误报状况的机制，如主张临床双瓶送检培育；树立微生物室预警机制，报警后当即涂片、转种平板，并结合血培育成长曲线、涂片染色成果跋涉一步的剖析等，有利于避免如本事例肺炎链球菌假阴性培育的发作，进步血培育的阳性检出率，削减漏报及误报的发作。
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（收稿日期：2016-11-20 本文修改：方菊花）
