魏冬梅+尹钢+刘锐+王蔷+王超男+邱学荣
[摘要]意图 针对性地搜集齐齐哈尔脑卒中患者的生物样本，构建标准化、高质量的脑卒中生物样本库，为齐齐哈尔市脑卒中疾病数据剖析和临床决议计划供给样本资源和数据支撑渠道。办法 制定标准化操作流程，挑选入库目标，搜集契合标准的患者血清、血浆、白细胞及从白细胞中提取的DNA和RNA，保存于-80℃冰箱或液氮中，进行DNA和RNA质量判定，确保供给高质量的临床样本资源。成果 从2013年起，该样本库已搜集753例患者，搜集血清、血浆样本各3008份，白细胞2253份，DNA、RNA样本各3770份。电泳成果显现，RNA电泳均呈现18S和28S两条带，无弥散现象，且28S条带亮度约为18S条带亮度的2倍，DNA电泳条带明晰，无缺性杰出。定论 开端树立了标准化、高质量的齐齐哈尔区域脑卒中生物样本库，以进一步探究和运用脑卒中样本资源，为往后脑卒中患者个体化医治供给协助。
[关键词]脑卒中；生物样本库；齐齐哈尔
[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）06（a）-0008-04
[Abstract]Objective To targeted collect the biological samples of patients with cerebral apoplexy in Qiqihar，to construct a standardized biological sample bank of cerebral apoplexy with high quality and provide sample sources and data supporting platform for the data analysis and clinical decisions for cerebral apoplexy in Qiqihar.Methods The standardized operative process was made，the object was selected，blood serum，blood plasma，white cells，DNA and RNA extracted from the white cells of the standardized patients were collected and stored in the refrigerator at -80℃ or liquid nitrogen.The quality of DNA and RNA was detected so that clinical sample sources with high quality were to be provided.Results From 2013，a total of 753 patients were enrolled in the sample bank.Samples of blood serum and blood plasma were 3008 respectively，white cells were 2253 and DNA and RNA were 3770 respectively.The results of electrophoresis showed the RNA electrophoresis had both 18S and 28S stripes without dispersion and the lumen of 28S stripe was as twice as that of the 18S stripe.DNA electrophoresis had clear stripes with good integrity.Conclusion The standardized biological sample banks of cerebral apoplexy with high quality in Qiqihar is primarily established to further explore and apply the data sources of cerebral apoplexy，which can provide help for individualized treatment of patients with cerebral apoplexy in the future.
[Key words]Cerebral apoplexy；Biological sample bank；Qiqihar
脑卒中是齐齐哈尔区域的高发疾病，严重危害人类健康，具有高发病率、高复发率、高致残率和高致死率的特色[1]。2008年原卫生部发布的《我国居民第三次死因回忆抽样查询报告》指出，脑血管疾病已成为导致我国居民逝世的首要原因，其间以脑卒中构成的危害为重[2]，给患者家庭和社会带来了沉重的担负。
近年来，临床研讨人员逐步意识到样本资源关于科研作业的重要性，开端注重临床生物样本的许多搜集和标准化的办理作业[3-5]。从2013年起，本院开端搜集样本，树立脑卒中患者的生物样本库，旨在为往后的医学研讨供给宝贵的临床样本资源。样本库的树立有助于探究脑卒中的发病机制，为脑卒中的临床医治供给协助。
1材料与办法
1.1首要设备
小液氮罐，-80℃超低温冰箱（三洋MDF-U73V型），低温高速离心机（Thermo MICRO21R型），纯水机（Milli-Q Reference），生物安全柜（海尔HR60-iiA2型），凝胶成像系统（UVP GelDoc -ITTS2型），微量核酸蛋白检测仪（ND2000型），涡旋振荡器（Vortex-Genie 2T型）。
1.2首要试剂
PBS缓冲液（北京索莱宝科技有限公司P1010），红细胞裂解液（QIAGEN79217），DNA提取试剂盒（碧云天生物技术研讨所D0063），Trizol（Thermo Fisher 15596-026），样本稳定剂（Ambion AM7020），氯仿（上海金穗生物科技有限公司67-66-3），异丙醇（济宁铭达新材料有限公司67-63-0），80%乙醇（济宁华凯树脂有限公司64-17-5）。
1.3研讨目标
以填表的方式对脑卒中患者进行流行病学查询，查询内容如下。①患者的一般状况：名字、年纪、性别、民族、寓居地址、文化程度及作业类别等；②疾病史：高血压、冠心病、肾病、糖尿病、脑卒中等既往病史及宗族病史；③生活习惯：是否吸烟、喝酒或长时间食用高盐或腌制品等；④临床信息：患者主诉、脑卒中亚型、并发症以及各类卒中相关评分等，依据查询状况断定入库目标。
1.4血液样本的搜集及处理
挑选契合标准的脑卒中患者，签署知情同意书，搜集患者空腹静脉血至抗凝管及非抗凝管中，2000 r/min离心10 min，汲取上清液分装，上清液分别为血浆和血清，置于-80℃冰箱或液氮中贮存。取抗凝管中层液体到10 ml离心管中，参加5 ml红细胞裂解液，置于摇床充沛混匀，2000 r/min离心10 min，弃去上清，重复2次，所得沉积用PBS洗刷并分装，即得白细胞，参加样本稳定剂，4℃过夜充沛浸透后冻存于-80℃冰箱或液氮中。
1.5 RNA和DNA的提取及判定
1.5.1 RNA提取及判定 1 ml Trizol吹散白细胞沉积，参加200 μl氯仿离心20 min，汲取上清到装有560 μl冷异丙醇的EP管中混匀，常温静置1 h，4℃，12 000×g离心10 min，弃去废液，参加1 ml 80%乙醇，8000 g离心3 min，弃去废液，重复该过程一次，所得沉积即为RNA，用RNase-free H2O溶解，分装后置于-80℃冰箱或液氮中冻存。
取1 μl提取后产品，用微量核酸蛋白检测仪检测RNA的浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳后查询其无缺性。
1.5.2 DNA提取及判定 DNA提取办法按DNA提取试剂盒说明书进行，产品分装后置于-80℃冰箱或液氮中冻存。
取1 μl提取后产品，用微量核酸蛋白检测仪检测DNA的浓度及纯度，2%琼脂糖凝胶电泳后查询其无缺性。
1.6存储样本的定时抽检
每年对样本进行抽样检测，按约1/500的份额随机抽取，通过微量核酸蛋白检测仪检测核酸的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA和RNA样本的无缺性。
2成果
2.1样本的搜集
脑卒中生物样本库于2013年开端树立，现已开端构成标准化、标准化的样本搜集、处理、保存流程及办理、质量操控系统，共搜集血清、血浆样本各3008份，白细胞2253份，DNA、RNA样本各3770份。
2.2 DNA质量判定
所提取的基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测，成果如图1，DNA电泳条带明晰，无缺性杰出无降解现象。运用核酸蛋白检测仪检测，光密度OD260/OD280值为1.8～2.0，提示无RNA和蛋白污染。
2.3 RNA质量判定
所提取的RNA样本经琼脂糖凝胶电泳检测，成果如图2，可见明晰的18S和28S两条带，且28S条带亮度约为18S条带亮度的2倍。运用核酸蛋白检测仪检测，光密度OD260/OD280值为1.7～2.0，提示RNA提取质量杰出，无降解且纯度高。
2.4样本贮存质量判定
微量核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳检测成果显现，所抽检的DNA和RNA样本未呈现降解等现象，浓度及纯度与未冻存前比较无显着差异，样本保存质量杰出（图3、图4）。
3评论
脑卒中是一组以脑安排缺血及出血性损害为首要临床表现的脑血管病[6]，影响要素许多，因而对脑卒中患者的数据信息进行标准化办理十分重要。一个优异的样本库信息化办理系统的树立可以带来重要的科研价值[7-8]。现在，国内已建起不同规划的脑卒中数据库，如新疆石河子市人民医院树立的新疆区域脑卒中数据库[9]、湖南湘潭市第二人民医院树立的湘潭区域脑卒中数据库[10]等。研讨人员可运用数据库资源，探究并总结其发病的现状及特色，为脑卒中的防备和医治供给牢靠依据，这对标准和进步该区域脑血管病的全体诊治水平具有重要作用。近年来，跟着分子生物学的快速开展，相关医学研讨[11-13]显现，疾病的发作大多与基因相关。生物样本作为进一步基因水平研讨及个体化医治（personalized medicine）的根底[14]，是不行再生的宝贵资源。现在，本院的脑卒中样本库已开端树立，样本库的操作标准、道德程序、信息办理系统的建造及样本的存储程序等已根本老练，从2013年开端，共搜集血清、血浆样本各3008份，白细胞2253份，DNA、RNA样本各3770份，树立了标准化、高质量的脑卒中生物样本库，为脑卒中更深化的研讨供给了根底。
高质量的生物样本是取得牢靠研讨数据的根底[15]，为新确诊目标的发现及新药的研制供给了确保，对人类疾病个体化猜测、确诊、医治的研讨具有重要意义[16]。本院生物样本库制定了一套无缺的样本质量办理系统，技术人员上岗前需通过严厉的系统训练，从血液样本的搜集到样本的运送、处理、保存及信息办理均能熟练掌握；定时进行标准操作训练和考评，确保每个环节都能得到有用的履行。血液样本搜集后如不能立刻处理，需先置于4℃冰箱内保存，在3～5 h内别离血清、血浆，否则会导致细胞结构改变和核酸蛋白降解。现在对血清、血浆等血液类样本没有特别抱负的通用质量检验办法，整个流程严厉的质量操控是首要的质量确保手法[17]。定时随机抽样及样本用户的质量信息反应关于样本质控也具有重要意义[18]。抽样成果及反应定见能及时发现问题，进而制定相应的纠正办法。如果是技术人员的操作问题，应从头进行标准操作训练；如果是流程办法问题，应及时进行优化改善，进一步确保样本质量。本研讨成果显现，抽检样本的DNA条带无缺明晰，无拖尾现象，提示DNA样本保存无缺，无降解；RNA条带的28S、18S明晰可见，提示RNA无缺性好，无显着降解；抽样检测成果证明本院脑卒中生物样本库DNA、RNA保存无缺，可满意大部分试验要求，也证明依据本院的标准化操作流程，搜集的样本质量可以得到确保。
现在，生物样本库的建造受到了广阔科研作业者的注重，已树立了不同病种的生物样本库[19-20]，但仍存在一些问题，如单个样本库操作不行标准、流行病学材料缺少或缺失等，而且大多数生物样本库都是独立存在的，可以满意为科研供给样本的根本需求，但还不行灵敏、全面地对生物样本库进行最有用合理的使用[14]。齐齐哈尔区域脑卒中样本库这一资源渠道，不只是满意本身研讨的需求，更要寻求国内及国际间的协作沟通，为其他科研作业者供给高质量的样本，更好地完成对外沟通，最大程度地促进转化医学的开展。
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（收稿日期：2016-01-12 本文修改：祁海文）
