细胞间粘附分子5ICAM5 重组蛋白
杨和平 张贵强 谢荣汉
【摘要】目的 分析细胞间粘附分子5（ICAM-5）对抗阿糖胞苷的抑制作用。方法 将转染ICAM-5基因的PAJU-TLN细胞株与转染空载体的PAJU-NEO细胞株分别添加阿糖胞苷培养，并于24 h、48 h与72 h时观察两组细胞株的形态变化、存活率与凋亡率。结果 两组细胞株均受到阿糖胞苷一定程度的抑制，与PAJU-NEO细胞株相比，PAJU-TLN细胞在72 h受到阿糖胞苷抑制的形态损害较轻，24 h、48 h、72 h的存活率明显高于PAJU-NEO细胞株组，且凋亡率低于PAJU-NEO细胞株组。结论 ICAM-5在PAJU细胞表达后具有对抗阿糖胞苷抑制的作用，其能减轻细胞毒性，减少细胞凋亡，能够保护和营养神经。
【关键词】粘附分子5；PAJU细胞；阿糖胞苷；保护作用
【中图分类号】R733.72 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2016.30.0.02
细胞间粘附分子5（Intercellular adhesion molecule-5，ICAM-5）是指参与细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质之间相互作用的分子之一，是一种表达于神经元的糖蛋白，因其特异性地表达于端脑内，故又被称作端脑素[1]。临床研究认为，ICAM-5具有促进神经元生长、营养神经、抗神经元凋亡的作用，可以对抗神经系统的毒性损害[2]。而阿糖胞苷（arabinocytidine，Ara-C）是一种作用于细胞S增殖期的嘧啶类抗代谢药物，可通过抑制细胞的DNA合成，来干扰细胞的增殖，临床多将该药应用于急性白血病的治疗中[3]。但Ara-C对神经元有一定的毒副作用，可能会诱导神经元凋亡，从而影响患者的智力。因此，临床亟需采取有效措施来解决这一问题。鉴于ICAM-5具具有神经元保护作用，本文就分析ICAM-5具对抗阿糖胞苷抑制的机制，现作如下
报道。
1 材料与方法
1.1 材料
（1）基本器械设备：无菌操作室、净化台、倒置相差显微镜、荧光显微镜倒置相差光学显微镜（TS100）、CO2培养箱、酶标仪、水纯化系统、离心管、培养板、移液管及其他小器械（2）试剂：阿糖胞苷、胎牛血清、青/链霉素溶液（100×）、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺（200 mmol/L）、DMEM/F12（体积比1：1）、HEPES（1 mmol/L）、二甲基亚砜、MTT、Hoechst、羊抗人ICAM-5多克隆抗体及兔抗羊异硫氰酸荧光素等；（3）细胞株：人ICAM-5常表达的人源性神经母细胞瘤细胞株PAJU细胞（PAJU-TLN）、无ICAM-5表达且转染空载体的人源性神经母细胞瘤细胞株PAJU细胞（PAJU-NEO）。
1.2 方法
（1）细胞维持培养：将PAJU-TLN与PAJU-NEO均置于全培养基中维持培养，全培养基由青/链霉素溶液、HEPES、胎牛血清、L-谷氨酰胺、DMEM等试剂融合而成，PH值为7.3。将上述两组细胞株置入全培养基中，并在37℃、5% CO2的培养箱中进行培养，每隔3～5d更换培养基，取对数生长期的细胞进行实验操作。
（2）建立抑制细胞增殖模式：根据操作标准配制抑制培养试剂，以0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，将其置于4℃下避光保存。将备用的阿糖胞苷加入抑制培养液中并作最后配制。将对数生长期的PAJU-TLN和PAJU-NEO细胞株以胰蛋白酶消化后，将细胞密度调整至105个/mL。将细胞接种于准备好的无菌24孔板中，以两株细胞的维持培养液培养24 h观察细胞贴壁及生长情况。分别选取PAJU-TLN与PAJU-NEO中生长良好的复孔3个，均加入含有阿糖胞苷的抑制培养液培养，连续观察到72 h时细胞株死亡为实验终点。分别取24 h、48 h、72 h三个时间段，在倒置相差显微镜下观察PAJU-TLN与PAJU-NEO细胞株的存活情况。然后弃去孔内培养液，以PBS快速洗一遍，加入4%的多聚甲醛固定15～20 min，接着弃去多聚甲醛，再以PBS洗一遍。加入PBST渗透10 min，PBS振洗3次，以5%的BSA封闭30 min。加入羊抗人ICAM-5多克隆抗体，在湿盒37℃感作30 min后，于避光下加入绿色荧光标记的兔抗羊异硫氰酸荧光素，在湿盒37℃感作40 min，继续避光，于荧光显微镜下观察并照相存档。
（3）细胞活性测：以105/孔的密度将PAJU-TLN与PAJU-NEO分别接种于96孔板中，分别在加有阿糖胞苷的抑制培养液中培养24 h、48 h、72 h三个时间段后，各孔分别加入MTT（sigma）继续培养4 h。然后吸弃培养液，以二甲基亚砜溶解后，应用酶标仪检测吸光度值。
（4）细胞核凋亡率检测：将对数生长期PAJU-TLN与PAJU-NEO细胞以104密度接种于24孔板中，分别在加阿糖胞苷的抑制培养液中培养24 h、48 h、72 h定时取出，以PBS洗一遍。用4%的多聚甲醛固定20 min后，PBS振洗2次。以1mg/mL的Hoechst 33258（Sigma）避光染色15 min，封片后继续避光，于荧光显微镜下观察拍照，并计算细胞核的凋亡比例。
2 结 果
2.1 细胞形态
未添加阿糖胞苷时，PAJU-TLN与PAJU-NEO两组细胞株在形态上无明显差异；添加阿糖胞苷后，随着时间不断延长两组细胞株形态也在不斷变化（见表1）。至抑制培养72 h，通过更换培养液PAJU-TLN细胞株可重新增殖传代，而PAJU-NEO细胞株全部消亡，无法复活。
2.2 细胞存活率与凋亡率
未添加阿糖胞苷时，两组细胞自然生存率基本一致；添加阿糖胞苷后，PAJU-TLN组细胞24 h、48 h、72 h存活率明显大于PAJU-NEO组细胞。
正常培养条件下，经过Hoechst 33258细胞核染色，绝大多数细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光。添加阿糖胞苷前，两组细胞凋亡率基本一致。添加阿糖胞苷后，PAJU-TLN组细胞24 h、48 h、72 h凋亡率明显小于PAJU-NEO组细胞。
3 讨 论
目前，临床虽认为ICAM-5具有营养神经、抗神经元凋亡的作用，但对其抵抗阿糖胞苷抑制作用尚未见资料报道。文章便以ICAM-5对抗阿糖胞苷抑制为论点，进行试验分析与论述。通过本次实验发现，转染空载体的PAJU-NEO细胞株在使用阿糖胞苷后，细胞形态明显改变，72 h后细胞几乎全部死亡；而转染ICAM-5基因的PAJU-TLN细胞株使用阿糖胞苷后，72 h内形态损害较轻，虽出现细胞凋亡，但72 h仍有一半左右的细胞株存活，且可能继续增殖传代。由此认为，ICAM-5确有抵抗阿糖胞苷毒性，对PAJU细胞进行内源性保护和营养神经作用。
参考文献
[1] 杨和平，彭 熠，杨力强，等.端脑素在缺氧环境中对PAJU细胞的保护作用[J].中国科技信息，2010，10（10）217-219.
[2] 宋琳衍.癌胚抗原相关细胞粘附分子5、6在膀胱尿路上皮癌组织中的表达及意义[J].中国老年学杂志，2013，11（33）：5595-5596.
[3] 刘海龙，曲彦明，黄铂渊，等.叶酸受体介导的阿糖胞苷抑制髓母细胞瘤增殖并促其凋亡的体外实验研究[J].中华神经外科杂志，2015，31（5）：514-518.
本文编辑：刘帅帅
