孟晓华 尚彩娟 岳晓云 张丽梅 金秀平
【摘要】糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者常见的微血管并发症，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。转化生长因子一β1（TGF-β1）是介导糖尿病肾病发生、发展最主要的细胞因子。水飞蓟素是目前广泛应用在肝病领域的天然药物提取物，已有部分研究证实其对2型糖尿病及糖尿病肾病患者有一定的治疗作用。本实验通过观察水飞蓟素对2型糖尿病肾病大鼠肾组织中TGF-β1的影响，探讨其对2型糖尿病肾病的影响机制。
【关键词】水飞蓟素；型糖尿病肾病；大鼠；生长因子
1材料与方法
1.1材料
清洁级雄性SD大鼠45只（由华北理工大学实验动物中心提供），体重180-220克。水飞蓟素由山东健康药业有限公司生产。兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体、SP系列试剂盒购自Boster公司。链脲佐菌素（STZ）购自Sigma公司。
1.2动物分组、2型糖尿病肾病模型的建立及药物干预、标本收集
将45只大鼠随机分为3组（每组各15只）：对照组（A组）、模型组（B组）、水飞蓟素组（C组）。A组给予常规饲料喂养，B组、C组参照文献建立2型糖尿病肾病大鼠模型：给予高脂高糖饲料（炼猪油18%，蔗糖20%，蛋黄粉3%，常规饲料59%）喂养30天诱导胰岛素抵抗后，腹腔注射STZ（25mg/kg）。72小时后尾静脉采血测随机血糖，并留取24h尿液测24小时尿蛋白定量，以随机血糖≥16.7mmol/L，24h尿蛋白定量≥30 mg/d为2型糖尿病肾病模型造模成功。造模成功的C组在STZ注射1周后给予水飞蓟素（30mg/kg∥d）灌胃，B组给予等量自来水灌胃，每日1次，共8周。灌胃第8周末，将大鼠置于代谢笼中，禁食、自由饮水，收集24h尿液备检。实验结束乙醚麻醉，腹主动脉取血待备检。迅速切取肾组织，去包膜后放入10%甲醛溶液固定备检。
1.3观察指标
1.3.1肾功能及24 h尿蛋白定量测定
自动生化分析仪测定血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）；免疫比浊法测定24h尿蛋白定量。
1.3.2病理学观察
将10%甲醛固定后的肾组织常规石蜡包埋，制作厚度为5μm石蜡切片，HE染色，光学显微镜观察肾组织病理变化。
1.3.3肾组织TGF-β1的表达
采用SP法行免疫组织化学染色半定量检测肾组织TGF-β1蛋白的表达。光镜下阳性部位为棕黄色，细胞核呈淡蓝色。应用IPP6.0图像分析系统观察，每张切片随机选取10个不含肾小球和血管的不重叠的肾小管问质区域视野，计算视野下累积光密度值（integrated optiondensity，IOD）和有效目标分布区域的面积（area，A）。用IOD/A得到平均光密度值（mean density），作为半定量指标用作分析。
1.4统计学分析
计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组问比较应用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，应用SPSS17.0统计软件处理分析，以P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠肾功能及24h尿蛋白定量结果
与A组比较，B组血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与B组比较，C组的各项指标均有所减低，差异有统计学意义（P<0.05）。（见表1）
2.2各组大鼠肾组织HE染色
光镜下，A组肾小球、肾小管结构完整，间质无炎性细胞浸润；B组肾小球系膜细胞增生、系膜基质增多，部分肾小球表现为结节样硬化，部分肾小管扩张、上皮细胞空泡样变性，肾间质有明显炎性细胞浸润，并有局灶性纤维化；与B组比较，C组上述病变均有一定程度减轻。（见图1-3）。
2.3各组大鼠肾组织TGF-β1的表达
光镜下观察，A组肾小球系膜细胞无或有极微弱TGF-β1表达；B组可见TGF-β1主要表达于肾小球上皮细胞、系膜细胞及系膜区，其着色部位广泛，呈棕黄色颗粒状，肾小管上皮细胞也有不同程度表达。C组TGF-β1表达部位与B组一致，但表达量较B组显著下降（P<0.01）。
3讨论
2型糖尿病导致的肾脏损害可累及肾小球、肾小管、肾间质、肾血管等几乎所有肾脏结构。由于糖尿病患者机体存在极其复杂的代谢紊乱，一旦出现肾功能损害，其进展速度远快于非糖尿病肾病患者，且治疗更加棘手，因此寻找更加有效的防治措施，已成为当前糖尿病学界和肾脏病学界十分急迫的课题。
糖尿病肾病发病机制十分复杂，细胞因子参与了糖尿病肾病发生和发展的诸多过程，转化生长因子-β1（TGF-β1）是最主要的细胞因子。无论DN早期还是晚期肾组织内TGF-β1基因与蛋白水平均明显增加。它的作用包括以下几个方面：①调节细胞增殖、分化和凋亡。②介导肾脏胶原沉积，可刺激多种基质成分和合成，减少细胞外基质的降解。③刺激细胞合成整合素，触发细胞之间以及细胞与细胞外基质的相互作用。
水飞蓟素是是从菊科药用植物水飞蓟种子的种皮中提取出来的植物提取物，具有对抗脂质过氧化、抑制纤维化、促进蛋白合成、促进脂肪转移等作用，目前已广泛应用在临床肝病领域。近年的研究发现，水飞蓟素对2型糖尿病及糖尿病肾病也有一定的治疗作用，但其作用机制尚不十分明确。本实验采取高脂高糖饲料喂养诱导胰岛素抵抗后注射小剂量STZ轻度破坏胰岛B细胞，成功制备了与临床贴近的2型糖尿病肾病模型，实验结果显示，与模型组相比，水飞蓟素治疗组大鼠肾功能受损减轻，尿蛋白排出量减少，且TGF-β1在肾组织中的表达量明显减少。
综上所述，水飞蓟素对2型糖尿病肾病大鼠肾脏具有保护作用，其可能机制之一是通过下调TGF-β的表达。
