黄芪多糖的提取工艺及含量测定研究
陈玉玲
【摘要】目的：黄芪为豆科植物，具有补气固表、利尿托毒、排毒敛疮、利水消肿、增强免疫的功能，主要药理成分是黄芪多糖和黄芪甙。黄芪多糖在医学临床上研究应用较为广泛，黄芪多糖的提取及含量测定具有重要意义。方法：水提取法采用蒸馏水煮沸提取；CaO溶液提取法采用pH9-10的CaO溶液煮沸提取，浓缩为1：0.8. 结果：经方法学考察，精密度、稳定性、重复性和回收率的RSD分别为0.08%、1.4%、2.3%、2.6%，范围内线性关系良好。结论：所建立的多糖提取和测定方法简单、快速、准确，可用于黄芪汤剂中总多糖的提取和含量测定。
【关键词】黄芪汤；多糖提取；含量测定研究
Extraction and determination of polysaccharide in Radix Astragali Decoction
Chen Yuling
（Wuhan City Huangpi District Hospital of traditional Chinese medicine pharmacy Hubei Wuhan 430300）
【Abstract】Objective： Astragalus for leguminous plants， with Qi solid form， diuresis， detoxification Tuodu sores， detumescence， enhance immune function， main pharmacological component is the astragalus polysaccharide and astragaloside. Astragalus polysaccharides in clinical medicine research is widely used， extraction and determination of polysaccharide of Radix Astragali has important significance. Methods： the water extraction by using distilled water boiling extraction； CaO solution extraction method using CaO solution for pH9-10 extraction， concentration of 1：0.8. results： the jurisprudence， precision， stability， repeatability and recovery rate of RSD were 0.08%， 1.4%， 2.3%， 2.6%， the linear relationship is good. Conclusion： the polysaccharides extraction and determination method is simple， rapid， accurate， and can be used for extraction and determination of total polysaccharides of Astragalus decoction.
【keyword】Huangqi Decoction； extraction； Determination of content
【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2014）04-0006-02
黄芪为豆科植物，具有补气固表、利尿托毒、排毒敛疮、利水消肿、增强免疫的功能，药理实验表明，黄芪多糖作为一种免疫抑制剂，具有保护急性心肌缺血，对抗心率失常，改善微循环的作用；白术多糖能调节免疫功能；甘草多糖为甘草重要的活性成分之一，具有抗补体和促有丝分裂等免疫调节作用以及抗肿瘤、抗病毒等作用[1]。因此，多糖是黄芪汤中的主要药效成分之一。目前，黄芪、白术、甘草单味药中多糖的提取分离和含量测定的报道较多[2-4]，我们采用蒸馏水煮沸提取黄芪汤中的多糖，用苯酚-硫酸法对多糖进行含量测定，为黄芪汤的进一步研究奠定基础。
1 仪器与试药
VIS- 723G可见分光光度计，LD -510离心机，101A -2型恒温干燥箱，HH -2数显恒温水浴锅，FA1004N电子天平，SHZ -Ⅲ型循环水真空泵。防己、黄芪、甘草、白术药材葡萄糖对照品（含量测定用，纯度大于99%）购自中国药品生物制品鉴定所；无水乙醇、苯酚和浓硫酸等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 多糖的提取取工艺研究
2.1.1 多糖的提取：取黄芪汤全方14g（黄芪5g、白术3g、甘草2g，下同），各加12倍量水煎煮3次，每次1.5h，用4层纱布过滤，合并滤液，浓缩为1：0.8（1g生药相当于0.8mL药液），加入95%乙醇，使含醇量为70%，低温静置12h以上，以4000r/min，离心10min，弃去上清液，取沉淀用水溶解，再离心一次，取上清液浓缩至1：08，加入95%乙醇，使含醇量为80%，低温静置12h以上，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤，抽干，在恒温干燥箱50℃干燥，得多糖提取物[2]。
2.1.2 加水量的考察：称取黄芪汤药材14g共3份，第一份加8倍量水煎煮2次，每次2 5h，第二份加l2倍量水煎煮3次，每次1.5h，第三份加25倍量水煎煮2次，每次2h，分别用4层纱布过滤，合并滤液，其余按“2.5”项下的操作，加水量为药材量12倍时，多糖提取率达9. 7%.是较高的。
2.1.3 药液相对浓度的考察：称取黄芪汤药材42g（、.黄芪15g.白术9g、甘草6g），加12倍量的水煎煮3次，每次1.5h后，过滤浓缩，滤液平均分成三份，分别浓缩为1：0.8、1：1、1：1.2，分别加入95%乙醇，使含醇量为70%，其余按“2.5”项下的操作。结果多糖含量分别为12.2%、8.6%、4. 3%，从实验结果可知，当药液相对浓度为1：0.8时，多糖提取率较高。
2.2 多糖的含量测定研究
2.2 1 供试品溶液的制备：精密称取多糖提取物0. lg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.1mg/mL溶液，精密移取2.5mL稀释液，置50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，振荡摇匀，备用[5|。
2.2.2 标准溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100.6mg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密吸取溶液10mL，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.100 6 mg/mL的葡萄糖标准溶液。
2.2.3 最大吸收波长的选择：精密移取葡萄糖标准溶液和供试品溶液各1.0mL，分别置10mL具塞试管中，加蒸馏水使成2.0mL，精密加入1.0mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0ml浓硫酸，静置5min后，置沸水浴中反应15min后取出并放至室温，于400-600mm范围内扫描。测得两者的最大吸收波长均为为490mm。
2.2.4 标准曲线的制备：分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置25mL具塞试管中，加蒸馏水使成2.0mL，精密加入1.0mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0mL浓硫酸，静置5min后，置沸水浴中反应15min后取出并放至室温，于490mm处测定吸光度（ A）。以吸光度A对浓度C进行线性回归，计算回归方程A=60. 047C -0.000 6.r=0. 999 7。浓度C在0.001 2一0.001 3 mg/mL范围内线性关系良好。
2.2.5 精密度试验：精密移取对照品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下操作，测定吸光度，连续测定6次，吸光度的RSD为0.08%，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验：精密移取供试液1. 0mL按“2.2.4”项方法操作，测定吸光度。每隔30min测定一次，连续2.5h考察其稳定性，吸光度的RSD为1.6%，结果表明样品溶液在2.5h内显色稳定。
2.2.7 重复性试验：称取黄芪汤剂的药材共14g，按“2.1.1”项下方法操作，得多糖提取物1. 882 9g，精密称取多糖提取物0.1g，共6份，按“2.2.1”项下操作配制供试品溶液，分别精密移取供试品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下方法测定，并计算多糖提取物中多糖相对含量，平均为92.7%，再换算成黄芪汤剂中多糖的含量，平均为12.4%，RSD为2.6%，结果表明该方法重复性良好。
2.2.8 加样回收试验：精密称取同一多糖提取物0.05 g，共6份，分别精密加入葡萄糖标准品适量，其余按“2.2.7”项下操作，计算多糖回收率，结果见表。
表1 回收率试验测定结果
2.2.9 祥品含量测定
称取黄芪汤剂的药材14g，共6份，按“2.1.1”项下方法操作，得多糖提取物，精密称取多糖提取物0. 1g，按“2.2.1”项下操作配制供试品溶液，分别精密移取供试品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下方法测定，求得多糖的含量，实验结果见表2：
表2黄芪汤的多糖含量测定结果
3 讨论
黄芪多糖属于极性大分子化合物，主要由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖组成。研究发现，多糖的生物活性与分子量、溶解度、粘度、一级结构和高级结构有关，因此多糖提取时应根据其有效成份的不同来设计工艺路线。 试验中同时比较测定了黄芪、白术、甘草各单味药材中多糖的含量，结果显示黄芪汤中多糖的平均含量为13. 1%，全方汤剂的多糖含量略高于黄芪、白术、甘草单药汤剂的多糖含量之和。
有关文献报道[5]用不同浓度的汤剂进行醇沉时，浓度太高或太低都会实验结果，本实验孝察显示药液相对浓度为1：0.8时，多糖提取率较高。采用水煮醇沉法报提取黄芪汤中的多糖是可行的，但步骤比较多，要求操作规范。实验过程应注意：（1）取样要均匀；（2）在醇沉时，加乙醇的速度和振摇频率要控制得当；（3）加入苯酚硫酸显色剂时，应悬空移液管，垂直快速加入。
杨莲芳、刘珍等[5]复方制剂中的多糖进行试验，表明样品经纯化处理后用苯酚-硫酸法，更适用于多糖含量测定，本实验由于时间有限，没有对提取的多糖进行纯化，所以实验结果重复性稍差。在后继续研究时，可考虑对多糖进一步纯化以便提高重复性。
参考文献
[1]季宇彬主编，中药多糖的化学与药理[M].北京：人民卫生出版社，2005.
[2]邓瑞生，张述斌，王必慧，等，黄芪多糖的提取和含量测定研究[J]，国外畜牧学报，2009，12（1）：50-51.
[3]马艳.白术多糖提取工艺研究[J]. 中药材，2006，29（10）：107-109.
[4]刘晔伟，宋海，马振远，等，甘草多糖提取工艺的研究[J]. 中成药2006，28（5）
[5]杨莲芳，刘珍，复方制剂中多糖含量测定方法研究[J]. 现代中医药，2009，29（5）：17-18
2.2 多糖的含量测定研究
2.2 1 供试品溶液的制备：精密称取多糖提取物0. lg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.1mg/mL溶液，精密移取2.5mL稀释液，置50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，振荡摇匀，备用[5|。
2.2.2 标准溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100.6mg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密吸取溶液10mL，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.100 6 mg/mL的葡萄糖标准溶液。
2.2.3 最大吸收波长的选择：精密移取葡萄糖标准溶液和供试品溶液各1.0mL，分别置10mL具塞试管中，加蒸馏水使成2.0mL，精密加入1.0mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0ml浓硫酸，静置5min后，置沸水浴中反应15min后取出并放至室温，于400-600mm范围内扫描。测得两者的最大吸收波长均为为490mm。
2.2.4 标准曲线的制备：分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置25mL具塞试管中，加蒸馏水使成2.0mL，精密加入1.0mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0mL浓硫酸，静置5min后，置沸水浴中反应15min后取出并放至室温，于490mm处测定吸光度（ A）。以吸光度A对浓度C进行线性回归，计算回归方程A=60. 047C -0.000 6.r=0. 999 7。浓度C在0.001 2一0.001 3 mg/mL范围内线性关系良好。
2.2.5 精密度试验：精密移取对照品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下操作，测定吸光度，连续测定6次，吸光度的RSD为0.08%，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验：精密移取供试液1. 0mL按“2.2.4”项方法操作，测定吸光度。每隔30min测定一次，连续2.5h考察其稳定性，吸光度的RSD为1.6%，结果表明样品溶液在2.5h内显色稳定。
2.2.7 重复性试验：称取黄芪汤剂的药材共14g，按“2.1.1”项下方法操作，得多糖提取物1. 882 9g，精密称取多糖提取物0.1g，共6份，按“2.2.1”项下操作配制供试品溶液，分别精密移取供试品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下方法测定，并计算多糖提取物中多糖相对含量，平均为92.7%，再换算成黄芪汤剂中多糖的含量，平均为12.4%，RSD为2.6%，结果表明该方法重复性良好。
2.2.8 加样回收试验：精密称取同一多糖提取物0.05 g，共6份，分别精密加入葡萄糖标准品适量，其余按“2.2.7”项下操作，计算多糖回收率，结果见表。
表1 回收率试验测定结果
2.2.9 祥品含量测定
称取黄芪汤剂的药材14g，共6份，按“2.1.1”项下方法操作，得多糖提取物，精密称取多糖提取物0. 1g，按“2.2.1”项下操作配制供试品溶液，分别精密移取供试品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下方法测定，求得多糖的含量，实验结果见表2：
表2黄芪汤的多糖含量测定结果
3 讨论
黄芪多糖属于极性大分子化合物，主要由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖组成。研究发现，多糖的生物活性与分子量、溶解度、粘度、一级结构和高级结构有关，因此多糖提取时应根据其有效成份的不同来设计工艺路线。 试验中同时比较测定了黄芪、白术、甘草各单味药材中多糖的含量，结果显示黄芪汤中多糖的平均含量为13. 1%，全方汤剂的多糖含量略高于黄芪、白术、甘草单药汤剂的多糖含量之和。
有关文献报道[5]用不同浓度的汤剂进行醇沉时，浓度太高或太低都会实验结果，本实验孝察显示药液相对浓度为1：0.8时，多糖提取率较高。采用水煮醇沉法报提取黄芪汤中的多糖是可行的，但步骤比较多，要求操作规范。实验过程应注意：（1）取样要均匀；（2）在醇沉时，加乙醇的速度和振摇频率要控制得当；（3）加入苯酚硫酸显色剂时，应悬空移液管，垂直快速加入。
杨莲芳、刘珍等[5]复方制剂中的多糖进行试验，表明样品经纯化处理后用苯酚-硫酸法，更适用于多糖含量测定，本实验由于时间有限，没有对提取的多糖进行纯化，所以实验结果重复性稍差。在后继续研究时，可考虑对多糖进一步纯化以便提高重复性。
参考文献
[1]季宇彬主编，中药多糖的化学与药理[M].北京：人民卫生出版社，2005.
[2]邓瑞生，张述斌，王必慧，等，黄芪多糖的提取和含量测定研究[J]，国外畜牧学报，2009，12（1）：50-51.
[3]马艳.白术多糖提取工艺研究[J]. 中药材，2006，29（10）：107-109.
[4]刘晔伟，宋海，马振远，等，甘草多糖提取工艺的研究[J]. 中成药2006，28（5）
[5]杨莲芳，刘珍，复方制剂中多糖含量测定方法研究[J]. 现代中医药，2009，29（5）：17-18
2.2 多糖的含量测定研究
2.2 1 供试品溶液的制备：精密称取多糖提取物0. lg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.1mg/mL溶液，精密移取2.5mL稀释液，置50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，振荡摇匀，备用[5|。
2.2.2 标准溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100.6mg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密吸取溶液10mL，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.100 6 mg/mL的葡萄糖标准溶液。
2.2.3 最大吸收波长的选择：精密移取葡萄糖标准溶液和供试品溶液各1.0mL，分别置10mL具塞试管中，加蒸馏水使成2.0mL，精密加入1.0mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0ml浓硫酸，静置5min后，置沸水浴中反应15min后取出并放至室温，于400-600mm范围内扫描。测得两者的最大吸收波长均为为490mm。
2.2.4 标准曲线的制备：分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置25mL具塞试管中，加蒸馏水使成2.0mL，精密加入1.0mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0mL浓硫酸，静置5min后，置沸水浴中反应15min后取出并放至室温，于490mm处测定吸光度（ A）。以吸光度A对浓度C进行线性回归，计算回归方程A=60. 047C -0.000 6.r=0. 999 7。浓度C在0.001 2一0.001 3 mg/mL范围内线性关系良好。
2.2.5 精密度试验：精密移取对照品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下操作，测定吸光度，连续测定6次，吸光度的RSD为0.08%，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验：精密移取供试液1. 0mL按“2.2.4”项方法操作，测定吸光度。每隔30min测定一次，连续2.5h考察其稳定性，吸光度的RSD为1.6%，结果表明样品溶液在2.5h内显色稳定。
2.2.7 重复性试验：称取黄芪汤剂的药材共14g，按“2.1.1”项下方法操作，得多糖提取物1. 882 9g，精密称取多糖提取物0.1g，共6份，按“2.2.1”项下操作配制供试品溶液，分别精密移取供试品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下方法测定，并计算多糖提取物中多糖相对含量，平均为92.7%，再换算成黄芪汤剂中多糖的含量，平均为12.4%，RSD为2.6%，结果表明该方法重复性良好。
2.2.8 加样回收试验：精密称取同一多糖提取物0.05 g，共6份，分别精密加入葡萄糖标准品适量，其余按“2.2.7”项下操作，计算多糖回收率，结果见表。
表1 回收率试验测定结果
2.2.9 祥品含量测定
称取黄芪汤剂的药材14g，共6份，按“2.1.1”项下方法操作，得多糖提取物，精密称取多糖提取物0. 1g，按“2.2.1”项下操作配制供试品溶液，分别精密移取供试品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下方法测定，求得多糖的含量，实验结果见表2：
表2黄芪汤的多糖含量测定结果
3 讨论
黄芪多糖属于极性大分子化合物，主要由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖组成。研究发现，多糖的生物活性与分子量、溶解度、粘度、一级结构和高级结构有关，因此多糖提取时应根据其有效成份的不同来设计工艺路线。 试验中同时比较测定了黄芪、白术、甘草各单味药材中多糖的含量，结果显示黄芪汤中多糖的平均含量为13. 1%，全方汤剂的多糖含量略高于黄芪、白术、甘草单药汤剂的多糖含量之和。
有关文献报道[5]用不同浓度的汤剂进行醇沉时，浓度太高或太低都会实验结果，本实验孝察显示药液相对浓度为1：0.8时，多糖提取率较高。采用水煮醇沉法报提取黄芪汤中的多糖是可行的，但步骤比较多，要求操作规范。实验过程应注意：（1）取样要均匀；（2）在醇沉时，加乙醇的速度和振摇频率要控制得当；（3）加入苯酚硫酸显色剂时，应悬空移液管，垂直快速加入。
杨莲芳、刘珍等[5]复方制剂中的多糖进行试验，表明样品经纯化处理后用苯酚-硫酸法，更适用于多糖含量测定，本实验由于时间有限，没有对提取的多糖进行纯化，所以实验结果重复性稍差。在后继续研究时，可考虑对多糖进一步纯化以便提高重复性。
参考文献
[1]季宇彬主编，中药多糖的化学与药理[M].北京：人民卫生出版社，2005.
[2]邓瑞生，张述斌，王必慧，等，黄芪多糖的提取和含量测定研究[J]，国外畜牧学报，2009，12（1）：50-51.
[3]马艳.白术多糖提取工艺研究[J]. 中药材，2006，29（10）：107-109.
[4]刘晔伟，宋海，马振远，等，甘草多糖提取工艺的研究[J]. 中成药2006，28（5）
[5]杨莲芳，刘珍，复方制剂中多糖含量测定方法研究[J]. 现代中医药，2009，29（5）：17-18
