献血-献血注意事项-献血
邵家幼
【中图分类号】R446.1 【文献标识码】B 【文章编号】2095-6851（2017）10--01
血液质量是当前输血管理工作中一项重要课题。为了保证血液质量，确保临床输血安全有效，遏制经血传播疾病的发生，卫生主管部门规定各采供血机构，应分别对献血者采用ELISA法进行HBs—Ag、抗一HCV、抗一HIV、TP等各项指标的检测，并制定了各种质量标准、操作规程和技术规范。
酶联免疫吸附试验（ELISA）具有敏感性高、特异性强、操作简便等优点，是目前采供血机构对献血者血液标本进行安全性指标检测主要的方法。近年来，各种自动化检测仪器设备在血站检验科得到了普遍应用，人员素质及检测试剂质量不断提高，检验质量得到了充分保证。但仍有一些困扰实验室人员的问题需要注意及解决，现探讨如下。
1 ELISA的基本原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高敏感性的实验技术，几乎所有的可溶性抗原一抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达ng甚至pg水平。该方法的基本原理如下：（1）将抗原或抗体结合到某种固相载体（目前以聚苯乙烯微量滴定板最为常用）表面，并保持其免疫活性。此步骤称为“固相载体的包被”，在商品化试剂盒中均已完成。（2）再将抗原或抗体与某种酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）连接成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。检测时，按相应顺序加入待检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体，使其与固相载体上的抗原或抗体发生反应。以洗涤的方法洗去各步骤中过量的未结合物质，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（3）最后加入酶反应的底物，底物即被酶催化生成有色产物，而有色产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定量分析。此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
2 ELISA的分类
ELISA方法既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。根据样本中待测物质的种类及性质不同，可以设计出各种不同类型的检测方法。临床检验工作中用到的ELISA方法主要分为以下几种类型：（1）用于检测抗原的：双抗体夹心法和竞争法；（2）用于检测抗体的：双抗原夹心法、间接法、竞争法及捕获包被法等。
3 ELISA检测的操作要点
在ELISA操作中有以下几个步骤较为关键：（1）加样：加样要准确，试剂应垂直滴加，不得倾斜、人为的加大试剂量。使用一次性吸头，防止交叉污染。定期校准加样器。标本应加在微孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不要溅出及产生气泡。（2）温育：96孔酶标板结构特别，易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围孔与内部孔的升降温速率不同，造成周边与内部孔结果有差异。因此，温育过程中应该用封板膜封闭整块板，尽量避免边缘效应的产生。温箱温度必须严格控制，温育时间也应按说明书规定力求准确。（3）洗板：冼涤是ELISA操作的重要环节，手洗条件一致性较差，對结果影响较大，半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果。洗涤时确认洗液注满每个板孔，但不可溢出板孔，弃液后将孔内液体在吸水纸上拍干。为了洗涤效果更好，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，在机器洗涤后再进行人工洗板1-2次，或适当增加洗板的次数。（4）显色终止：显色时间应严格按说明书的规定。应在显色终止15min内进行酶标仪读取。
4 ELISA检测中常见问题
4.1 ELISA测定中存在的“灰区”问题
ELISA是一种定性试验，必须在“阳性”与“阴性”之间有一条明确的分界线，也就是所谓的“阳性判断值”（Cutoff），样本的吸光度值（A）大于等于Cutoff值就判读为阳性，否则则判读为阴性。然而在实际工作中经常会出现样本的吸光度值（A）低于但接近Cutoff值的情况，即ELISA检测中的“灰区”。对于这种情况，为输血安全考虑，常常将这些血液报废。在实际工作中可将“灰区”设在Cutoff值的70%，即对于样本的吸光度值（A）在Cutoff值的70%到阳性判断值之间的将其报废。通过灰区的设定，血液安全能得到更好的保障。
4.2 “钩状效应”（Hookeffect）问题
“钩状效应”系指在一步法ELISA中，测定显色随着待测标本中抗原或抗体浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原或抗体浓度的增加而开始下降直至不显色，而出现假阴性结果的问题。在血液筛查中，有可能因“钩状效应”的存在而出现假阴性的主要是HBsAg和抗HIV的检测。目前，国内HBsAg的检测均为一步双抗体夹心法，抗HIV有一些采用了双抗原夹心法。尽管试剂生产厂家在固相和标记抗体或抗原的选择匹配上，采取了结合位点远离或含多个可结合位点的方法，在很大程度上，可以避免或减轻“钩状效应”，但如果某一批试剂外理不好或是特定的标本，仍有可能出现由“钩状效应”所致的假阴性。解决“钩状效应”的最好的办法，就是采用两步法试剂盒，其次就是对每一批试剂盒使用前，采用能得到的最强阳性的标本，进行有关“钩状效应”的质检。
4.3 试剂盒的质检、初检和复检试剂的选用
试剂盒从厂家到用户手中，还会出现运输和贮存过程中对试剂盒质量有影响的问题。因此，试剂盒在使用前必须进行质检，质检的重点包括试剂盒的有效期、测定下限、抗干扰能力以及对特殊标本的检出能力等方面。如何选择初、复检试剂，也是值得注意的一个问题。比如，HCV感染者血循环中存在针对HCV不同蛋白的抗体，而具体针对某种蛋白抗体是否出现、出现的时间、持续时间长短均有所差异，因此，ELISA测定时所使用的包被抗原必须全面，才能有效地检出所存在的抗体。但在实际工作中，由不同的抗HCVELISA试剂盒生产厂家所使用的HCV抗原的来源、质量及包被浓度各有差异，使测定中对同一份样本所测定的结果有时会出现很大的差异，尤其是对较弱阳性的样本或仅出现针对HCV单个蛋白成分的抗体的样本。因此，在选择初检和复检试剂盒时，最好选择在测定不同HCV蛋白抗体上有互补性的试剂盒，从而最大程度的避免漏检。
4.4 标本的影响
标本因素包括标本溶血、被污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。
4.4.1 标本溶血 血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶活性，因此以辣根过氧化物酶为标记的酶联免疫吸附试验测定中，如血清中血红蛋白浓度较高，很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的辣根过氧化物酶反应显色，造成假阳性。因此在采血过程中应注意，采集血液标本时应让血液自动靠负压注入试管以防标本溶血。
4.4.2 标本被污染 菌体可能含有内源性过氧化物酶，可出现非特异性显色，因此宜用新鲜标本，如有特殊情况，应冰箱保存或冰冻保存，并应加盖保存。
4.4.3 标本的保存 标本在冰箱中保存时间过长，可能造成污染或效价降低，可引起假阴性，因此应尽量用新鲜标本。冰冻标本应避免反复冻融，因冰冻标本的反复冻融产生的机械力对标本中的蛋白分子有破坏作用，可引起假阴性。
4.4.4 标本凝固不全 凝固不全的血清中有部分纤维蛋白原，影响结果。
4.5. 环境因素
实验室环境也是保证结果可靠的因素之一，应做好以下控制：①通风、采光与防尘；②环境温度与湿度随地理位置不同可有很大差异，应使用系统空调进行控温，并控制环境湿度在要求的范围内；③消除噪音与电磁干扰；④实验过程中应采用蒸馏水（纯水）。
5 小结
ELISA检测受多方面因素的影响，检测人员应提高工作责任心，加强质量控制意识，努力学习业务理论知识，提高专业技术水平，不断总结经验，避免人为因素对实验结果的影响，加强各环节质量管理，严格控制关键控制点，保证血液检验分析前、分析中、分析后各阶段质量，不断改进提高检验质量，确保临床输血的安全性和有效性。endprint
