中国黑社会性质组织5大类型揭密
边坤+袁洪恩+王玉梅+穆维新
【摘要】目的 探讨细胞凋亡效应因子半胱天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）及半胱天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）在乳腺癌合并2型糖尿病患者癌组织及单纯乳腺癌患者癌组织中的表达。方法 应用免疫组织化学方法检测单纯乳腺癌患者（单纯癌组）及乳腺癌合并2型糖尿病患者（糖癌组）癌组织石蜡标本中caspase-3和caspase-9的表达变化。结果 单纯癌组及糖癌组癌组织中caspase-3及caspase-9表达有差异，糖癌组两者表达均低于单纯癌组，两者吸光度值分别为（0.313±0.001）、（0.223±0.002）（p<0.01），（0.362±0.001）、（0.247±0.001）（p<0.01），有统计学意义。结论：Caspase-3 、caspase-9表达在两组内均与肿瘤的大小、淋巴结转移数目、患者年龄、组织学分级均无统计学意义（P>0.05）。但糖癌组患者在肿瘤体积、区域或远处淋巴结转移及组织学分级比单纯癌组更严重，有统计学意义（P<0.05），而ER、PR及HeHer-2表达在糖癌组和单纯癌组间无明显差异（P>0.05）。Caspase-3及caspase-9参与了乳腺癌合并2型糖尿病的发生发展，可能是乳腺癌合并2型糖尿病患者预后不良的机制之一。
【关键词】半胱天冬氨酸蛋白酶-3；半胱天冬氨酸蛋白酶-9；乳腺癌合并2型糖尿病
【中图分类号】R587.1 R737.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2014）04-0004-01
近几年，越来越多的国内外研究发现糖尿病患者发生乳腺癌的风险明显增高[1-3]。且糖尿病增加乳腺癌发病率、死亡率并预后不良。其发病机制不详，国内外研究报道较少。本研究利用免疫组化方法观察细胞凋亡效应因子半胱天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）及半胱天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）在乳腺癌合并2型糖尿病患者癌组织及单纯乳腺癌患者癌组织中的表达变化，探讨糖尿病增加乳腺癌发病率、死亡率增多的可能机制之一。
1 资料与方法
1.1 一般资料
我们回顾分析了河北医科大学第四医院收治的自2011年1月至2012年2月住院的乳腺癌患者石蜡切片标本及住院病例资料，其中抽取乳腺癌合并2型糖尿病患者（糖癌组）99例，且2型糖尿病发病时间均超过5年，该组病人的诊断符合1999年世界卫生组织（World health organization，WHO）提出的诊断标准，均在二级以上医院副主任医师以上临床诊断，无明显自发酮症倾向，以口服降糖药控制血糖，均未使用胰岛素治疗，血糖控制不佳，糖化血红蛋白（HbAlc）均大于7.5%。随机抽取同时间段除外2型糖尿病的单纯乳腺癌患者（单纯癌组）120例做对照组，两组均经手术病理证实为乳腺癌，术前均未行放化疗治疗，且两组患者均除外患有高血压病、免疫性疾病等全身性疾病。其中乳腺癌合并2型糖尿病组患者99例，年龄35～81岁，平均（53.2±9.0）岁；组织学类型：浸润性导管癌85例，浸润性小叶癌6例，乳腺髓样癌3例，低分化腺癌2例，乳腺浸润性导管癌合并黏液腺癌1 例，乳腺浸润性导管癌合并浸润性小叶癌1例，乳腺浸润性导管癌伴有肉瘤样变1例。单纯乳腺癌组患者120例，年龄34～79岁，平均（48.5±10.0）岁，组织学类型：浸润性导管癌112例，浸润性小叶癌6例，乳腺浸润性导管癌合并浸润性小叶癌2例。两组患者年龄经以乳腺癌为因变量进行非条件Logistic回归分析认为没有差异性（P>0.05）。
1.2 2型糖尿病诊断标准
糖尿病诊断标准为1999年世界卫生组织（WHO）发布标准：满足以下任意1项即是，（1）糖尿病症状+任意时间血浆葡萄糖≥11.1 mmol/L（200mg/dl）；（2）空腹血浆葡萄糖（FPG）≥7.0 mmol/L（126 mg/d1）；（3）餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L（200mg/d1）。
1.3 试剂来源
一抗FN，CTGF SMA兔抗IgG多克隆抗体购于博士德生物技术有限公司，PCNA 鼠抗IgG单克隆抗体。SP9001试剂盒及DAB显色剂购于北京中山生物技术有限公司。
1.4 方法
两组病例均手术后取乳腺癌组织标本，经10%中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，切片，分别进行苏木素-伊红（HE）染色，并光镜病理复查确诊，诊断标准根据2003年WHO组织学分类标准[4]。Caspase-3和caspase-9的检测采用链亲和素-生物素-过氧化物酶法（streptavidin-biotin-immunoperoxidase，S-P）。简单操作步骤如下：连续石蜡切片，厚4μm。石蜡切片常规脱蜡至水，3%甲醇-过氧化氢溶液室温下避光孵育10分钟，蒸馏水冲洗，0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）PH7.4清洗3次，0.1mol/L枸橼酸缓冲液（PH6.0）微波炉内修复98℃维持20分钟后自然冷却至室温，0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）PH7.4清洗5分钟，滴加10%山羊血清，37℃温箱孵育30分钟，滤纸吸去多余血清，加入一抗（兔抗caspase-3 1：100，兔抗caspase-9 1：100），0.01mol/LPBS清洗，滴加生物素标记的二抗工作液，37℃温箱孵育30分钟，0.01mol/LPBS清洗，每张切片滴加辣根酶HRP标记链霉卵白素工作液，37℃温箱孵育30min，0.01mol/LPBS清洗，后用3，3-二氨基联苯胺显色2-5分钟，自来水充分冲洗，终止显色，常规梯度酒精脱水，透明中性树脂封固行实验判断。阴性对照用PBS替代一抗，其余步骤同上。
1.4.1数据处理：用OLYMPUS全能显微镜BX-UCB下观察并收集图象，所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内在相同的放大倍数下，每个切片计数10个视野，FAK以阳性细胞染色的平均吸光度（OD）值来表示抗原表达量；所有资料录入微机，建立数据库。
1.4 .2 实验判断：在细胞质和/或细胞核内表达，阳性反应均呈棕黄或黄色颗粒， 阴性对照：在细胞核和细胞质内均无表达，苏木精对比染色后核呈蓝色。每张切片随机采集图片（×400倍）10张，其详细操作均按试剂盒说明进行。
1.5 统计学方法
本研究实验数据采用用SPPSS（13.0）软件包进行统计学分析，集中趋势及离散趋势述用均数及标准差描述，计量资料应用以均数±标准差（（x±s）表示，两组间计量资料比较采用t检验，两因素多组间的比较用配伍组设计方差分析，两两比较用p检验，单因素两组间比较用t检验，检验水准（α=0.05）。P < 0.05 即认为具有统计学意义。
2 结果
2.1 caspase-3免疫组织化学结果
淡黄色或棕黄颗粒在细胞核及细胞质均有表达，以细胞质表达为主。在糖癌组，癌细胞融合明显，结构不清晰，坏死组织较多，结缔组织多，棕黄色颗粒颜色较浅；单纯癌组癌细胞明显，轮廓较为清楚，棕黄色颗粒较深。在细胞质表达较多，在糖癌组及单纯癌组癌细胞间组间表达有差异，有统计学意义。糖癌组组内平均吸光度值为（ 0.223± 0.002）明显低于单纯癌组组内平均吸光度值（0.313± 0.001）（p<0.01），有统计学意义，见表1，图1A、1B。
Table 1 Caspase-3、caspase-9 expressed and pathological characteristic of breast cancer with type 2 diabetes mellitus 、 non-diabetic patients cancer tissue
A：caspase-3 prortein expression in simple breast cancer carcinoma tissue；B： caspase-3 prortein expression in breast cancer with type 2 diabetes mellitus；C caspase-9 prortein expression in simple breast cancer carcinoma tissue；D ： caspase-9 prortein expression in breast cancer with type 2 diabetes mellitus
图1免疫组织化学染色caspase-3、caspase-9在乳腺癌组织中的表达（DAB×400）
Figure 1 caspase-3 and caspase-9 prortein expression in breast cancer tissue stained by immunohistochemistry （DAB×400）
2.2 caspase-9免疫组织化学结果
caspase-9阳性信号在单乳腺癌组及糖癌组癌细胞核、细胞质均有表达，以细胞质表达为主，为浅黄至棕黄色颗粒，同样在糖癌组癌细胞融合明显，结构模糊，有较多的坏死组织及结缔组织，棕黄色颗粒颜色较浅，而单纯癌组癌细胞组织明显，结构清晰，棕黄色颗粒较深，在糖癌组及单纯癌组癌细胞间组间表达有差异，有统计学意义。糖癌组组内平均光密度值为（0.247 ± 0.001）明显低于单纯癌组组内平均吸光度值（0.362 ± 0.001）（p<0.01），差异有统计学意义，见表1，图1C、1D。
2.3 caspase-3、caspase-9的表达与乳腺癌临床病理参数的关系
结合临床资料综合分析显示：Caspase-3 、caspase-9蛋白表达在两组内均与肿瘤的大小、淋巴结转移数目、患者年龄组织学分级均无统计学意义（P>0.05），见表1。但糖癌组患者在肿瘤体积、区域或远处淋巴结转移及组织学分级比单纯癌组更严重，有统计学意义（P<0.05），而ER、PR及Her-2表达在糖癌组和单纯癌组间无明显差异（P>0.05），见表2。
3 讨论
糖尿病与多种恶性肿瘤相关，Michels等[5]研究发现糖尿病能增加乳腺癌的发病率，因此糖尿病是乳腺癌个体化治疗的考虑因素之一。部分流行病学研究结果显示：糖尿病可显著增加癌症死亡率，有糖尿病和没有糖尿病的乳腺癌比较，5年死亡率明显增多（风险比1.39）[6]。 在预后方面，糖尿病患者乳腺癌死亡率升高。研究表明糖化血红蛋白>7%的妇女乳腺癌死亡率是糖化血红蛋白<6.5%的妇女的2倍以上（HR：2.35；95%CI：1.56～3.54），同时糖化血红蛋白>7%的患者无病生存期缩短[7]，但两者的相互关系不详。目前对恶性肿瘤细胞中细胞凋亡效应因子caspase-3及其激活分子caspase-9在肿瘤中的表达的研究还较少，尚未见有关乳腺癌合并2型糖尿病癌组织中Caspase-3，-9的表达和细胞凋亡状况的报导。本研究对乳腺癌合并2型糖尿病患者癌组织中Caspase-3，-9的表达进行了研究，探讨乳腺癌合并2型糖尿病患者癌组织中细胞凋亡紊乱的情况，以及它们在乳腺癌合并2型糖尿病癌组织发生发展中的作用及其对预后的作用，试图探讨乳腺癌合并2型糖尿病预后不良的可能机制。
细胞凋亡在生物进化上是一种高度保守的细胞死亡机制。细胞凋亡异常会引起多种疾病的发生，如自身免疫性疾病、代谢性疾病、神经退行性疾病和恶性肿瘤等等。细胞增殖和凋亡失衡与肿瘤发生发展有密切关系，在不同的肿瘤中两者的关系有不同的表现。Caspase家族被认为是细胞凋亡的核心机制，其异常表达可导致细胞的异常增殖和恶性转化，最终导致肿瘤发生发展的多种病理状态[8-9]。目前已知的三条凋亡信号传导通路中Caspase都起着关键作用，Caspase-3的作用最为重要。Caspase-3是caspase家族中最关键的凋亡执行者之一，其表达异常在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用[10-11]。国内外文献报道多种肿瘤中都存在caspase-3的表达异常。如口腔鳞状细胞癌、肝癌、宫颈癌和胰腺癌等肿瘤中caspase-3表达增高，胃癌、结肠癌、霍杰金淋巴瘤等肿瘤中caspase-3表达降低[12，16]。Caspase-9是caspase家族中另一很重要的一员。其主要参与细胞凋亡的线粒体途径。许多刺激剂如化疗药物、紫外线辐射和应激分子（如活性氧和活性氮）等诱导的细胞凋亡都存在线粒体的功能紊乱，并且认为它的出现是导致细胞不可逆死亡的关键环节[17]。
国内外对乳腺癌合并2型糖尿病患者癌组织中caspase-3、caspase-9的表达和细胞凋亡状况及其对患者预后的影响目前尚末见报导，因此研究乳腺癌合并2型糖尿病癌组织中caspase-3、caspase-9的表达和细胞凋亡及预后影响的具体情况，不仅有利于探讨乳腺癌合并2型糖尿病癌组织中细胞凋亡通路紊乱的状况对预后不良的影响，也可以了解细胞凋亡在乳腺癌合并2型糖尿病癌组织形成和发展中的作用，而且对开发利用caspase治疗乳腺癌合并2型糖尿病患者也将有重要的实践价值。
本实验研究表明，Caspase-3 、caspase-9蛋白表达在两组内均与肿瘤的大小、淋巴结转移数目、患者年龄、组织学分级均无统计学意义（P>0.05）。但糖癌组患者在肿瘤体积、区域或远处淋巴结转移及组织学分级比单纯癌组更严重，有统计学意义（P<0.05），而ER、PR及HeHer-2表达在糖癌组和单纯癌组间无明显差异（P>0.05）。同时发现caspase-3 和caspase-9在乳腺癌合并2型糖尿病癌组织中相比单纯乳腺癌癌组织中表达降低，其机制可能使乳腺癌细胞在发展过程中细胞凋亡减少，增殖能力增强，对乳腺癌的发生、发展、转移、侵袭有促进作用，其表达的降低可能是预后不良的影响之一。本研究应用免疫组化技术检测样本中caspase-3蛋白的表达状况.结果阳性信号主要为胞浆弥漫分布，少许细胞核呈现阳性信号。这与文献报道一致[18-19]。国内邱芳等[20]、黄凌燕等[21]、李良宏等[22]研究结果发现乳腺癌组织中caspase-3阳性表达率低于癌旁组织，提示caspase-3表达降低，促进乳腺癌细胞凋亡减少，与乳腺癌的发生发展密切相关。caspase-9在乳腺癌中的低表达也可能和caspage-3低表达存在某种关联，两者的相互关系促使乳腺癌细胞凋亡减少，增殖增多，从而导致乳腺癌合并2型糖尿病患者预后不良。针对caspase-3 和caspase-9促凋亡作用，将可能为临床工作者提供直接有效的基因治疗，为乳腺癌合并2型糖尿病患者提供新的分子靶向治疗新方向。由于细胞凋亡异常在许多人体恶性肿瘤的发病学上占有十分重要的地位，人们有理由相信随着对细胞凋亡发生机制的深入认识，可望在恶性肿瘤的治疗学上取得新的突破。向肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因，选择性诱导肿瘤细胞凋亡的凋亡干预技术将可能成为治疗恶性肿瘤的基本策略，目前的实验显示caspase-3和caspase-9在肿瘤的基因治疗中具有巨大潜力[23-24]。但是，其前提是进一步深入认识凋亡紊乱在恶性肿瘤的发生发展中的确切机制和具体情况，尤其是处于核心地位的凋亡调节分子caspase3，-9等的变化。这仍然需要做大量开创性的工作。
参考文献
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[13]Angela Hague，John W Eveson，Marion MacFarlane，et al。Caspase-3 expression is reduced，in the absence of cleavage，in terminally differentiated normal oral epithelium but is increased in oral squamous cell carcinomas and correlates with tumour stage[J].Journal of Pathology，2004，204：175-82.
国内外对乳腺癌合并2型糖尿病患者癌组织中caspase-3、caspase-9的表达和细胞凋亡状况及其对患者预后的影响目前尚末见报导，因此研究乳腺癌合并2型糖尿病癌组织中caspase-3、caspase-9的表达和细胞凋亡及预后影响的具体情况，不仅有利于探讨乳腺癌合并2型糖尿病癌组织中细胞凋亡通路紊乱的状况对预后不良的影响，也可以了解细胞凋亡在乳腺癌合并2型糖尿病癌组织形成和发展中的作用，而且对开发利用caspase治疗乳腺癌合并2型糖尿病患者也将有重要的实践价值。
本实验研究表明，Caspase-3 、caspase-9蛋白表达在两组内均与肿瘤的大小、淋巴结转移数目、患者年龄、组织学分级均无统计学意义（P>0.05）。但糖癌组患者在肿瘤体积、区域或远处淋巴结转移及组织学分级比单纯癌组更严重，有统计学意义（P<0.05），而ER、PR及HeHer-2表达在糖癌组和单纯癌组间无明显差异（P>0.05）。同时发现caspase-3 和caspase-9在乳腺癌合并2型糖尿病癌组织中相比单纯乳腺癌癌组织中表达降低，其机制可能使乳腺癌细胞在发展过程中细胞凋亡减少，增殖能力增强，对乳腺癌的发生、发展、转移、侵袭有促进作用，其表达的降低可能是预后不良的影响之一。本研究应用免疫组化技术检测样本中caspase-3蛋白的表达状况.结果阳性信号主要为胞浆弥漫分布，少许细胞核呈现阳性信号。这与文献报道一致[18-19]。国内邱芳等[20]、黄凌燕等[21]、李良宏等[22]研究结果发现乳腺癌组织中caspase-3阳性表达率低于癌旁组织，提示caspase-3表达降低，促进乳腺癌细胞凋亡减少，与乳腺癌的发生发展密切相关。caspase-9在乳腺癌中的低表达也可能和caspage-3低表达存在某种关联，两者的相互关系促使乳腺癌细胞凋亡减少，增殖增多，从而导致乳腺癌合并2型糖尿病患者预后不良。针对caspase-3 和caspase-9促凋亡作用，将可能为临床工作者提供直接有效的基因治疗，为乳腺癌合并2型糖尿病患者提供新的分子靶向治疗新方向。由于细胞凋亡异常在许多人体恶性肿瘤的发病学上占有十分重要的地位，人们有理由相信随着对细胞凋亡发生机制的深入认识，可望在恶性肿瘤的治疗学上取得新的突破。向肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因，选择性诱导肿瘤细胞凋亡的凋亡干预技术将可能成为治疗恶性肿瘤的基本策略，目前的实验显示caspase-3和caspase-9在肿瘤的基因治疗中具有巨大潜力[23-24]。但是，其前提是进一步深入认识凋亡紊乱在恶性肿瘤的发生发展中的确切机制和具体情况，尤其是处于核心地位的凋亡调节分子caspase3，-9等的变化。这仍然需要做大量开创性的工作。
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国内外对乳腺癌合并2型糖尿病患者癌组织中caspase-3、caspase-9的表达和细胞凋亡状况及其对患者预后的影响目前尚末见报导，因此研究乳腺癌合并2型糖尿病癌组织中caspase-3、caspase-9的表达和细胞凋亡及预后影响的具体情况，不仅有利于探讨乳腺癌合并2型糖尿病癌组织中细胞凋亡通路紊乱的状况对预后不良的影响，也可以了解细胞凋亡在乳腺癌合并2型糖尿病癌组织形成和发展中的作用，而且对开发利用caspase治疗乳腺癌合并2型糖尿病患者也将有重要的实践价值。
本实验研究表明，Caspase-3 、caspase-9蛋白表达在两组内均与肿瘤的大小、淋巴结转移数目、患者年龄、组织学分级均无统计学意义（P>0.05）。但糖癌组患者在肿瘤体积、区域或远处淋巴结转移及组织学分级比单纯癌组更严重，有统计学意义（P<0.05），而ER、PR及HeHer-2表达在糖癌组和单纯癌组间无明显差异（P>0.05）。同时发现caspase-3 和caspase-9在乳腺癌合并2型糖尿病癌组织中相比单纯乳腺癌癌组织中表达降低，其机制可能使乳腺癌细胞在发展过程中细胞凋亡减少，增殖能力增强，对乳腺癌的发生、发展、转移、侵袭有促进作用，其表达的降低可能是预后不良的影响之一。本研究应用免疫组化技术检测样本中caspase-3蛋白的表达状况.结果阳性信号主要为胞浆弥漫分布，少许细胞核呈现阳性信号。这与文献报道一致[18-19]。国内邱芳等[20]、黄凌燕等[21]、李良宏等[22]研究结果发现乳腺癌组织中caspase-3阳性表达率低于癌旁组织，提示caspase-3表达降低，促进乳腺癌细胞凋亡减少，与乳腺癌的发生发展密切相关。caspase-9在乳腺癌中的低表达也可能和caspage-3低表达存在某种关联，两者的相互关系促使乳腺癌细胞凋亡减少，增殖增多，从而导致乳腺癌合并2型糖尿病患者预后不良。针对caspase-3 和caspase-9促凋亡作用，将可能为临床工作者提供直接有效的基因治疗，为乳腺癌合并2型糖尿病患者提供新的分子靶向治疗新方向。由于细胞凋亡异常在许多人体恶性肿瘤的发病学上占有十分重要的地位，人们有理由相信随着对细胞凋亡发生机制的深入认识，可望在恶性肿瘤的治疗学上取得新的突破。向肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因，选择性诱导肿瘤细胞凋亡的凋亡干预技术将可能成为治疗恶性肿瘤的基本策略，目前的实验显示caspase-3和caspase-9在肿瘤的基因治疗中具有巨大潜力[23-24]。但是，其前提是进一步深入认识凋亡紊乱在恶性肿瘤的发生发展中的确切机制和具体情况，尤其是处于核心地位的凋亡调节分子caspase3，-9等的变化。这仍然需要做大量开创性的工作。
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