沈艳玲等
[摘要] 意图 旨在研讨CTX联合BUS对Wister小鼠卵巢及前期肺功用危害安排结构的影响。 办法 选取2～3月龄的雌性Wister小鼠60只，随机分红四组：A正常对照组、B生理盐水组、C组CTX+BUS组、D组CTX+BUS+生理盐水组。C、D两组第1天以腹腔打针CTX负荷剂量50 mg/（kg·d），第2天开端8 mg/（kg·d）接连打针14 d，后皮下打针BUS10 mg/（kg·w），共2次。C组小鼠于第15天处死。D组于第15天开端打针生理盐水8 mg/（kg·d），共15 d，于第30天处死余组小鼠。在处理期间调查小鼠的一般状况、体重、各级卵泡数水平。以化学发光法测定各组小鼠血清中E2及FSH的水平，调查卵巢及肺安排惯例病理切片下的形状学改动。 成果 与A、B组卵巢比较，C组E2 显着下降、FSH水平显着添加、各级卵泡数量削减（P<0.05）。C、D组比较，E2 下降、FSH添加（P<0.05），两组各级卵泡计数虽削减，但差异无统计学含义。A、B组中E2、FSH、卵泡数量比较，差异无统计学含义。C组与A、B、D组肺安排比照，肺安排血管内皮细胞水肿， 肺泡距离内可见渗出液。A、B、C组肺安排形状无反常。 定论CTX+BUS使原始卵泡和初级卵泡的显着削减可能与小鼠卵巢中血E2下降有关，而且CTX+BUS也会形成一过性肺危害。
[关键词] 卵巢危害；性激素；一过性肺危害
The effects of cyclophosphamide and busulfan on ovarian injuries and early lung injury
SHEN Yanling WU Hui HUANG Huan YIN Tian LI Pan ZHAO Pin WU Changchu LUO Wenqi
Changsha Medical University， Changsha 410219， China
[Abstract] Objective To assess the effects of cyclophosphamide （CTX） and busulfan （BUS） on ovarian injuries and initial injury of lung. Methods Sixty female SD rats age of 2 to 3 months were divided into four groups： group A （control group）， group B （saline group）， group C （CTX+ BUS group）， group D （CTX+BUS+saline group）. SD rats of group C and group D were processed by intraperitoneal injection of CTX 50 mg/（kg·d） at the 1st day and then 8 mg/（kg·d） from day 2， for 14 days. SD rats of group C and group D were processed by subcutaneous injection of BUS 10 mg/（kg·w） for twice， and SD rats of group C were killed at day 15， whereas SD rats of group D had been processing by 8 mg/（kg·d） saline for another 15 days， and all of SD rats were killed at day 30. General conditions， weight， number of levels of folliole of rats of four group were observel every day. Estrogen （E2） and follicular stimulating hormone （FSH） were detected by chemiluminescence method. The lung and ovaries of each group were prepared for HE sections. Results Compared with A， B group of ovarian， levels of E2， number of levels of follicular， FSH in the group C decreased and increased significantly （P<0.05）. Compared with group D， C， E2 decreased， FSH increased （P<0.05）， two groups of follicle count at all levels was reduced， but there was no statistically significant difference. In group B and A， E2， FSH， number of follicles were compared， there was no statistically significant difference. Group C compared with group A， B， D in lung tissue， lung tissue vascular endothelial edema， can be seen in the alveolar interval exudate. Lung tissue form of A， B， C group without exception. Conclusion CTX together with BUS can induce primodial follicles and primary follicles undergo atresia， which can be close to the decreased level of E2. CTX together with BUS can also induce transitory pulmonary injury in early stage.
[Key words] Ovarian injury； Sex hormone； Transitory pulmonary injury
近年来恶性肿瘤趋于年青化，虽经化疗后患者的存活率显着进步，但一起对女人卵巢也形成必定的危害，如卵泡过早排空，包膜增厚，间质纤维化，进而卵巢早衰[1，2]。现在化疗药物对卵巢的副效果危害已逐步成为当今的研讨热门。其间，CTX和BUS为细胞周期非特异性烷化剂，其毒性不只效果于割裂增殖期细胞，也可效果于未发育的卵母细胞或原始卵泡中的前颗粒细胞，影响卵泡的发育和成熟[3]。还有报导部分解疗药物诱发肺纤维化所需的时刻较长，患者发病藏匿，不易引人注意[4]。如安在化疗时维护卵巢功用和肺功用是亟待解决的问题。本试验选取经典化疗药物环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）和白消安（Busulfex，BUS），调查其对卵巢功用和肺功用危害的影响，为深化探求化疗药物对卵巢功用及前期肺危害的防备及医治供给必定的试验根据。
1 材料与办法
1.1试验动物
具有正常性周期2～3月龄的雌性Wister小鼠60只，体重（23±2）g，由湖南斯莱克景达试验动物有限公司供给，运用准可证编号：SCXK（湘）2011-0003。全价颗粒饲料喂食，鼠料及饮用水均经灭菌处理，自在摄食，室温20℃～24℃，相对湿度45%～55%，每日光照12 h，昼夜替换。养殖1周后每日晨取阴道排泄物涂片，光镜下调查性周期。
1.2 试验药物
打针用环磷酰胺购自山西普德药业股份有限公司（粉剂，200 mg/支），国药准字：H14023686。白消安，购于Sigma公司，国药准字：B2635。试验时用生理盐水配成相应浓度的水溶液打针。
1.3 办法
1.3.1 分组及用药 将60只小鼠随机分红四组，每组15只。A组（正常组）。B组（生理盐水组）：每天腹腔打针平等剂量的0.9%生理盐水，接连30 d。C组（CTX+BUS组）和D组（CTX+BUS+生理盐水组）第1天以腹腔打针环磷酰胺负荷剂量50 mg/（kg·d），后以8 mg/（kg·d）的保持剂量接连打针14 d，打针环磷酰胺后皮下打针白消安10 mg/（kg·w），共2次。C组小鼠于第15天处死。D组于第15天开端打针生理盐水8 mg/（kg·d），共15 d，于第30天处死A、B、D组小鼠。以上所用动物均摘小鼠眼球以取血，4℃放置过夜后，2000 r/min离心10 min，别离血清于-20℃保存。用药期间调查小鼠一般状况（生命体征、进食状况、大小便、每日测体重1次）。
1.3.2 动情周期的断定 每天9：00取克己微细棉签蘸以0.9%生理盐水后，轻轻于小鼠阴道内旋转1圈，行阴道涂片，用95%乙醇固定5 min，显微镜下调查细胞的品种和形状。
1.3.3性激素水平的测定办法 选用化学发光法测定小鼠血清中的雌二醇（E2）、卵泡影响素（FSH）水平，试剂盒为德国Bayer公司出产，严厉依照试剂盒阐明进行操作。
1.3.4 安排形状学调查 C组小鼠第15天处死，取出双侧卵巢及肺，第30天处死余下组的小鼠。进行白腊切片后，HE染色并光镜下调查双侧卵巢和肺安排的形状学改动。别离计数各组小鼠的各级卵泡数并比较各组间的差异。
1.4 统计学处理
运用SPSS 12.0统计学软件进行统计剖析，计量材料选用两样本t查验和单要素方差剖析。P<0.05标明差异有统计学含义。
2 成果
2.1 各组小鼠的一般状况
A、B两组小鼠活动、摄食等一般状况正常，体重无下降，对外界影响的反响性好，灵活性强。C、D两组小鼠在腹腔打针CTX及皮下打针BUS后，体重逐步下降，活动削减，体毛暗淡无光泽，部分体毛剥脱，打针处皮肤呈现小溃疡，但可自愈。C、D两组于处理后第2天小鼠体重即下降，至第15天体重到达最低值；完毕打针化疗药后D组小鼠体重均略有添加，但仍低于对照组（t=6.776，P<0.05）。D组的体重与C组比较，差异有统计学含义（t=7.266，P<0.05）。A、B两组的体重比较，差异无统计学含义（P>0.05）。见表1。
2.2小鼠动情周期的测定
A、B组小鼠的动情周期为4～5 d，动情间期为1.5～2.5 d。A、B组涂片内上皮细胞、白细胞、角化细胞替换的周期性改动。C、D两组注入CTX及BUS后在呈现较长时刻上皮细胞及白细胞后，偶有一个角化细胞类型改动。跟着时刻的延伸，角化细胞呈现的频率削减。
2.3性激素水平的测定
注药完毕后，C、D两组小鼠激素水平发作显着改动。与A组比较，C、D两组E2水平显着下降（t=33.999、24.682，P<0.05），FSH水平显着升高（t=-11.296、-14.333，P<0.05）。其间D组与C组比较E2浓度低，FSH比C组高，有显着性差异（t=12.276、-10.207，P<0.05）。A、B组E2、FSH的差异无统计学含义（t=0.036、0.702，P>0.05）。见表1。
2.4小鼠卵泡计数
C、D组各级卵泡数量低于A、B组（P<0.05），其间以原始卵泡及初级卵泡下降最为显着，D组与C组比较卵泡数均有下降，但差异无统计学含义（P>0.05），这阐明CTX+BUS首要效果于原始卵泡和初级卵泡，影响卵泡的发育和成熟。见封三图2。
2.5 卵巢及肺形状学调查成果
HE染色后光学显微镜下调查，可见A、B组卵巢皮质的各级卵泡形状结构与髓质结构未见反常。肺安排形状结构也未见反常。C、D两组可见卵泡数目均显着削减，卵巢髓质萎缩，间质纤维化。C组肺安排血管内皮细胞水肿， 肺泡距离内可见渗出液。D组内皮细胞和上皮细胞均正常，阐明化疗药物可导致一过性肺危害。见封三图3。
3 评论
化疗是临床上医治免疫性疾病、血液病和肿瘤的重要手法之一，效果切当。化疗药物对靶细胞挑选性较差，在杀灭病变细胞的一起，对正常安排细胞也有不同程度的危害。其间，女人卵巢是化疗灵敏器官，化疗可形成卵巢功用危害，改动性激素水平，可使患者发作暂时或永久性闭经，乃至损失生育力，日子质量下降。现在有清晰卵巢毒性危害的烷化剂如环磷酰胺、白消安、氮芥等可致闭经、生育能力低下，其间白消安是联合化疗、手术的常用药物之一[5]，现在稀有据标明每添加1.0 g剂量的环磷酰胺，发作卵巢功用衰竭的几率大约添加 0.13倍[6]。因而本研讨挑选CTX腹腔打针+BUS皮下打针处理小鼠进行调查，卵巢HE染色可见C、D组小鼠卵巢安排中原始卵泡和初级卵泡的显着少于正常组，阐明CTX+BUS首要损坏处于发育中的卵泡，与王方圆的试验共同[7]。别的血清雌激素来源于卵巢的颗粒细胞，被视为卵巢储藏功用的直接目标[8]。本研讨显现，C、D组小鼠在给药后15 d，血清中E2显着下降，FSH显着上升，阐明CTX+BUS危害了卵巢的颗粒细胞然后使E2排泄下降，而D组持续给予平等剂量的生理盐水，在不损害小鼠卵巢的状况下卵巢危害的程度有所减慢，这可能与小鼠机体应激要素有关[9]。一起已有许多材料标明CTX可导致卵巢颗粒细胞的危害，其机制为卵泡内的某种信号被激活而促进细胞发作凋亡[10]，而这种机制有学者提出Bcl-2/bax的份额决议卵泡是否承受诱导凋亡的信号[11]。现在，Bcl-2宗族是较公认的凋亡调控因子之一，许多学者对此进行试验探求，梁欣韫研讨本身免疫性卵巢早衰小鼠卵巢颗粒细胞凋亡发作率高，一起Bax蛋白的表达显着上升，Bcl-2蛋白的表达显着下降[12]。朱玲研讨标明免疫性卵巢早衰大鼠Bcl-2蛋白的表达削弱，Bax蛋白的表达添加然后促进了卵泡过早过快的凋亡[13]。邱明宁进一步以山羊卵巢间质体外别离试验证明颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁与部分Bax基因的表达有关[14]。此刻有学者研讨去卵巢大鼠外源性弥补E2后，大鼠下丘脑各核团Bcl-2蛋白的表达添加，而Bax蛋白的表达削减或改动不显着的试验，证明了E2能调理Bcl-2/Bax的表达[15]。但是可能因为种属特异性，各试验成果存在差异。而本试验首要研讨CTX+BUS对卵巢的损坏成果，首要是小鼠卵巢原始卵泡和初级卵泡的耗竭和E2的显着下降，其试验机制可能是化疗药物促进E2削减，然后反常激活Bax基因的表达，诱导卵泡凋亡乃至耗竭[16]，由此猜想原始卵泡和初始卵泡的显着削减可能与E2的下降有关，而E2与卵泡凋亡及bcl-2/Bax三者间调理详细的效果机制，有待后续的相关研讨来证明。
别的，抗肿瘤药物可使许多恶性肿瘤患者获益，但这种获益是以药物毒性的发生为价值的，其间一部分患者可发作肺危害。化疗药物是引起药物性肺危害的重要原因，其间包含环磷酰胺、白消安、博来霉素等[17]。研讨标理解消安医治缓慢粒细胞白血病2～3年后，可引起肺纤维化，且常因呼吸衰竭或并发肺炎而逝世[18]。有相关试验研讨在医治相关的剂量浓度范围内，环磷酰胺及白消安对肺的影响小[19]。本试验发现化疗第15地利小鼠HE染色示肺部危害，第30天肺部HE肺安排内皮细胞及上皮细胞正常，考虑化疗药物使小鼠处于应激状况致前期肺危害，停药后肺部结构恢复正常。
化疗对卵巢功用的影响可引起不孕，对年青女人癌症患者化疗前怎么评价化疗可能对生育功用发生的影响，然后使患者取得更好的卵巢功用和生育能力，是现在临床妇科肿瘤医生有必要注重的课题，也是未来卵巢恶性生殖细胞肿瘤研讨的方向。一起持续讨论化疗药物对前期肺功用的影响，信任通过研讨者们的共同努力，将会为年青女人癌症患者化疗后保存生育力和正常肺功用供给更多、更有用、更安全以及更经济的医治办法[20]。
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