钟守军等
[摘要] 意图 评论血管内皮成长因子C（VEGF-C）表达和D2-40符号的微淋巴管密度（MLVD）与宫颈癌淋巴道搬运的联系。办法 使用全自动多功用安排病理检测体系检测80例宫颈癌安排中VEGF-C及D2-40表达，对D2-40阳性脉管进行MLVD计数。成果 宫颈癌安排中VEGF-C表达显着增高（49/80），而正常宫颈黏膜安排中未见VEGF-C表达；宫颈癌有淋巴结搬运组（20/26）VEGF-C表达水平较无搬运组（29/54）增高。宫颈癌安排中MLVD较正常黏膜安排增高；有淋巴结搬运组MLVD高于无搬运组，且宫颈癌安排中VEGF-C表达与MLVD呈正相关。定论 VEGF-C在宫颈癌安排中表达增高及MLVD计数增高与宫颈癌滋润、淋巴道搬运等生物学行为密切相关，可作为点评宫颈癌预后的重要生物学目标；VEGF-C可能促进淋巴管重生。
[关键词] VEGF-C；微淋巴管密度；宫颈癌；淋巴道搬运
[中图分类号] R739.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）22-0074-04
[Abstract] Objective To investigate the relationship of the expression of VEGF-C and MLVD with lymphatic metastasis in cervical carcinoma. Methods The immunohistochemistry expressions of VEGF-C and D2-40 were detected by the automatic multifunctional pathology detection system in 80 cases invasive squamous cell carcinoma of the uterine cervix. The MLVD was assayed by D2-40 positive vascular count. Results Expression of VEGF-C was significantly higher levels in cervical carcinoma（49/80）， and there was no expression in normal cervical mucosal tissues. VEGF-C expression in cervical carcinoma with lymph node metastasis （20/26） was significantly higher than those without lymph node matastasis（29/54）. MLVD in cervical carcinoma was significantly higher than those in normal tissues， and MLVD in cervical carcinoma with lymph node metastasis was significantly higher than those without lymph node matastasis. The VEGF-C expression was positively correlated with MLVD in cervical carcinoma. Conclusion The overexpression of VEGF-C and high MLVD are significantly correlated with cervical carcinoma progression and lymph node metastasis， which can be used as an important biological indicate to evaluate the prognosis of cervical cancer； VEGF-C may promote lymphangiogenesis.
[Key words] VEGF-C； MLVD； Cervical carcinoma； Lymphatic metastasis
宫颈癌是妇科常见而重要的生殖道恶性肿瘤，除直接延伸外，淋巴道搬运是其最重要和最常见的播散途径，也是决议患者生计及预后的重要要素之一，所以对有关宫颈癌淋巴道搬运机制的研讨具有非常重要的现实含义。既往因为缺少淋巴管内皮细胞特异性的标志物，是以肿瘤淋巴道搬运机制的研讨发展相对滞后，而且有关淋巴管与肿瘤间联系的研讨尚存在一些对立的成果。D2-40 是新近发现的一种特异性淋巴管内皮细胞标志物，具有较高的特异性和敏感性[1]。血管内皮成长因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是一种能特异性诱导淋巴管内皮细胞增殖、趋化的重要因子，研讨标明其表达水平与肿瘤的淋巴道搬运密切相关[2]。本研讨选用全自动多功用安排病理检测体系检测宫颈癌安排中VEGF-C及D2-40的表达，并调查计数肿瘤微淋巴管密度（microlymphatic vessel density，MLVD），以评论VEGF-C及MLVD与宫颈癌微淋巴管生成及淋巴道搬运的联系。
1 材料与办法
1.1 一般材料
80例宫颈鳞癌安排白腊标本均来自我院病理科2008年1月～2012年12月间存档蜡块。一切病例均施行宫颈癌彻底治愈术和盆腔淋巴结打扫，悉数患者术前均未接受过放疗或化疗，临床材料完好，均经病理安排学确诊。患者年纪29～70岁，均匀51.6岁，其中有盆腔淋巴结搬运26例，无盆腔淋巴结搬运54例，且依据世界抗癌联盟规矩，每例剥离的淋巴结数目均不少于10枚。另取20例同期手术切除子宫之正常宫颈安排作为对照组。endprint
1.2 办法
一切安排学标本均经10%中性缓冲福尔马林液固定，白腊包埋，4 μm接连切片。使用全自动多功用安排病理检测体系（BenchMark XT，美国罗氏）进行免疫安排化学染色。SSC清洗缓冲液、DAB显色液等均购自上海罗氏公司。一抗VEGF-C兔抗人多克隆抗体、D2-40兔抗人单克隆抗体均为上海长嘉生物科技有限公司产品。选用已知的宫颈鳞癌安排切片作为阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。
1.3 成果判读
VEGF-C阳性染色定坐落肿瘤细胞胞质，呈淡黄色或棕黄色颗粒样上色。依据染色阳性细胞的数量及其染色强度分为三级[3]：阳性细胞数>60%，大都细胞呈棕黄色至黄色染色，为强阳性表达（3+）；阳性细胞数<10%，染色强度为淡黄色或仅单个细胞呈棕黄色至黄色染色，为弱阳性表达（1+）；阳性细胞数及染色强度介于强阳性与弱阳性之间者，为中度阳性表达（2+）。凡免疫组化染色强度与布景无显着不同者均判读为阴性（-）。
D2-40阳性染色呈棕黄色颗粒样上色，定坐落淋巴管内皮细胞胞质。肿瘤MLVD的断定及计数办法[1]：依据D2-40在安排切片中的染色状况，以阳性染色的内皮细胞簇或单个内皮细胞别离计为一个阳性微淋巴管。首先在低倍镜下（×40）选定染色密布的5个区域，然后在高倍镜下（×200）别离计数所选定的5个视界中被染色的微淋巴管数目，取其均匀值作为该例的MLVD。
1.4 统计学处理
使用SPSS 13.0统计学软件对数据进行剖析处理。计量材料以均数±标准差（x±s）标明，选用单要素方差剖析；计数材料比较选用χ2查验（Fisher切当概率法）；使用Spearman等级相关剖析VEGF-C表达与MLVD的相关性；P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 VEGF-C在宫颈鳞癌中的表达
VEGF-C阳性表达呈淡黄色或棕黄色，首要定坐落肿瘤细胞胞质，偶见于脉管内皮细胞或间质细胞（图1）。宫颈鳞癌安排中VEGF-C表达阳性率约为61.25%（49/80），而20例正常宫颈黏膜安排中均未见VEGF-C表达，且宫颈鳞癌有淋巴结搬运组（20/26）VEGF-C表达水平较无淋巴结搬运组（29/54）增高，三组间比较差异有统计学含义（χ2=27.806，P=0.000）。两两比较（纠正α为0.05/3），正常宫颈安排别离与无淋巴结搬运组、有淋巴结搬运组之间比较差异有统计学含义（χ2=17.424、26.627，P=0.000）（Fisher切当概率法）；无淋巴结搬运组与有淋巴结搬运组之间比较差异有统计学含义（χ2=3.987，P=0.046）。见表1。
2.2 D2-40符号的微淋巴管形状学特色及MLVD计数
D2-40阳性染色定坐落淋巴管内皮细胞胞质，呈棕黄色或黄色颗粒样上色。正常宫颈黏膜安排中D2-40染色阳性的淋巴管数目较少，形状多较规矩，散布较均匀，重生微淋巴管较少见；而宫颈鳞癌安排中D2-40染色阳性微淋巴管散布显着增多而不规矩（图2），一般坐落癌巢周边区域，尤其在癌巢滋润前缘，多呈扩张状况，形状不甚规矩，大小不一，管壁较薄且无平滑肌安排，基底膜多不完好，腔内偶见淋巴细胞；也有的微淋巴管为几个内皮细胞组成的细胞簇或呈闭锁的条索样，有的乃至仅为单个内皮细胞；单个微淋巴管内可见癌栓（图3）。正常宫颈黏膜安排、宫颈鳞癌无淋巴结搬运组和有淋巴结搬运组MLVD计数别离为（2.42±0.64）、（6.73±0.91）、（9.87±1.02），经单要素方差剖析，三组之间比较差异有统计学含义（F=397.226，P=0.000）。经Newman-Keuls法两两比较，各组间差异均有统计学含义（q=26.198、39.853、20.929，P<0.01）。见表1。
2.3 VEGF-C表达与MLVD相关性
选用Spearman等级相关剖析标明，宫颈鳞癌安排VEGF-C表达与MLVD之间存在正相关（r=0.556，P<0.01）。
3 评论
宫颈癌是女人常见而重要的生殖道恶性肿瘤，除直接延伸外，淋巴道搬运是其最重要和最常见的播散途径，也是决议患者生计及预后的重要要素之一，是以有关宫颈癌淋巴道搬运机制的研讨具有非常重要的现实含义。既往因为缺少特异性的淋巴管内皮细胞符号物，因而有关肿瘤淋巴道搬运机制的研讨相对滞后，而且有关淋巴管与肿瘤之间联系的研讨中尚存在一些对立的成果。
D2-40 是新近发现的一种特异性的淋巴管内皮细胞标志物，它不与血管内皮细胞反响，而是与淋巴管内皮细胞特异性地结合反响，是现在较为抱负的淋巴管内皮细胞标志物，并现已开端使用于肿瘤淋巴管与肿瘤生物学联系的研讨[4]。肿瘤细胞所在的微环境状况，关于肿瘤细胞的成长、增殖以及侵袭、搬运起着重要的效果，而MLVD计数能够必定程度地反映肿瘤细胞所在的微环境状况。跟着肿瘤细胞的克隆性增殖，肿瘤体积不断增大，其诱导发作的微淋巴管数亦可不同程度添加，一起因为安排空隙水肿，导致肿瘤微淋巴管的敞开或扩张，然后有利于肿瘤细胞侵入淋巴道而进一步搬运分散。Takanami[1]研讨以为，以D2-40符号的MLVD计数是肿瘤淋巴道搬运的一个独立猜测因子。本组试验中发现宫颈鳞癌安排MLVD为（7.75±1.63），显着高于正常宫颈组（2.42±0.64）；且有淋巴结搬运组MLVD为（9.87±1.02），高于无淋巴结搬运组（6.73±0.91），三组之间差异均有统计学含义。一起，试验中还发现肿瘤微淋巴管多坐落癌巢周围，尤其是滋润的前缘部位，MLVD计数显着增多，且绝大大都微淋巴管形状不规矩，部分扩张显着，少量呈阻塞状况，标明在肿瘤发作淋巴道搬运的进程中，肿瘤周围安排中的微淋巴管发挥了重要的效果，与既往研讨成果相一致[5，6]。
VEGF-C又被称为淋巴管内皮成长因子，是VEGF宗族的新成员。其首要功用是经过与表达于淋巴管内皮细胞的VEGFR-3受体特异性结合，激活受体酪氨酸激酶信号体系，进一步诱导肿瘤构成新的淋巴管（淋巴管重生），并能促进肿瘤细胞进入微淋巴管，经过淋巴体系向全身分散和搬运[7]。研讨以为VEGF-C是恶性肿瘤一个独立的预后要素，其过表达不只能够促进肿瘤细胞的增殖，还可诱导肿瘤微淋巴管生成，并促进肿瘤细胞在淋巴管内的播散。在多种人体肿瘤安排的研讨中发现VEGF-C过表达与肿瘤的淋巴道搬运呈正相关[8]。本组研讨显现宫颈鳞癌安排中VEGF-C表达阳性率约为61.25%（49/80），而在正常宫颈安排中均未见VEGF-C表达，且宫颈癌有淋巴结搬运组（20/26）VEGF-C表达水平较无搬运组（29/54）增高，三组间差异均有统计学含义，标明宫颈癌细胞能够发作VEGF-C使之表达升高，并可能与宫颈癌的发作、开展及滋润、搬运等生物学行为密切相关，可作为点评宫颈癌预后的重要生物学目标之一。endprint
选用Spearman相关剖析标明，宫颈癌安排中VEGF-C表达水平与MLVD计数之间存在正相关，提示VEGF-C能够诱导肿瘤淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管构成，而且与肿瘤的淋巴道搬运密切相关。估测肿瘤细胞可能经过发作VEGF-C并与其受体特异性结合，然后诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管重生和扩张；而肿瘤MLVD计数添加为肿瘤细胞进一步侵入微淋巴管供给了更有利的条件，然后促进肿瘤细胞的淋巴道搬运[9]。
总归，尽管有关宫颈癌淋巴道搬运的详细机制尚不彻底清楚，但肿瘤的淋巴道搬运无疑是一个涉及到多个要素的多进程、多阶段的杂乱进程。在肿瘤的淋巴道搬运进程中，瘤细胞发作的VEGF-C可能发挥了重要效果。VEGF-C可经过与其特异性的受体结合诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管构成，并进一步促进肿瘤细胞的淋巴道分散和搬运，因而，临床检测VEGF-C表达及MLVD计数可作为点评肿瘤细胞诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管构成研讨的重要目标，并有助于临床对宫颈癌医治计划的点评及预后判别。
[参考文献]
[1] Takanami E. Lymphatic microvessel density using D2-40 is associated with nodal metastasis in non-small cell lung cancer[J]. Oncol Rep，2006，15（2）：437-442.
[2] 任彦武，顶峰. VEGF-C、Podoplanin与肿瘤淋巴管生成及搬运联系的研讨发展[J]. 癌症发展，2013，11（2）：155-158.
[3] 盛薇，王虎霞，王光芒，等. 乳腺癌VEGF-C的表达与淋巴管生成的相关性[J]. 西安交通大学学报（医学版），2008，29（6）：679-682.
[4] Saptefrait L，Cǐmpean AM，Ciornǐi A，et al. Identification of lymphatic vessels and prognostic value of lymphatic microvessel density in lesions of the uterine cervix[J]. Rom J Morphol Embryol，2009，50（4）：589-594.
[5] Yu H，Zhang S，Zhang R，et al. The role of VEGF-C/D and Flt-4 in the lymphatic metastasis of early-stage invasive cervical carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res，2009， 28（98）：1-6.
[6] Gombos Z，Xu X，Chu CS，et al. Peritumoral lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor C expression in early-stage squamous cell carcinoma of the uterine cervix[J]. Clin Cancer Res，2005，11（23）：8364-8371.
[7] Watanabe S，Kato M，Kotani I，et al. Lymphatic Vessel Density and Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Squamous Cell Carcinomas of Lip and Oral Cavity：A Clinicopathological Analysis with Immunohistochemistry Using Antibodies to D2-40，VEGF-C and VEGF-D[J]. Yonago Acta Med，2013，56（1）：29-37.
[8] Botting SK，Fouad H，Elwell K，et al. Prognostic significance of peritumoral lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor receptor 3 in invasive squamous cell cervical cancer[J]. Transl Oncol，2010，3（3）：170-175.
[9] Sotiropoulou N，Bravou V，Kounelis S，et al. Tumor expression of lymphangiogenic growth factors but not lymphatic vessel density is implicated in human cervical cancer progression[J]. Pathology，2010，42（7）：629-636.
（收稿日期：2014-03-18）endprint
选用Spearman相关剖析标明，宫颈癌安排中VEGF-C表达水平与MLVD计数之间存在正相关，提示VEGF-C能够诱导肿瘤淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管构成，而且与肿瘤的淋巴道搬运密切相关。估测肿瘤细胞可能经过发作VEGF-C并与其受体特异性结合，然后诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管重生和扩张；而肿瘤MLVD计数添加为肿瘤细胞进一步侵入微淋巴管供给了更有利的条件，然后促进肿瘤细胞的淋巴道搬运[9]。
总归，尽管有关宫颈癌淋巴道搬运的详细机制尚不彻底清楚，但肿瘤的淋巴道搬运无疑是一个涉及到多个要素的多进程、多阶段的杂乱进程。在肿瘤的淋巴道搬运进程中，瘤细胞发作的VEGF-C可能发挥了重要效果。VEGF-C可经过与其特异性的受体结合诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管构成，并进一步促进肿瘤细胞的淋巴道分散和搬运，因而，临床检测VEGF-C表达及MLVD计数可作为点评肿瘤细胞诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管构成研讨的重要目标，并有助于临床对宫颈癌医治计划的点评及预后判别。
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[9] Sotiropoulou N，Bravou V，Kounelis S，et al. Tumor expression of lymphangiogenic growth factors but not lymphatic vessel density is implicated in human cervical cancer progression[J]. Pathology，2010，42（7）：629-636.
（收稿日期：2014-03-18）endprint
选用Spearman相关剖析标明，宫颈癌安排中VEGF-C表达水平与MLVD计数之间存在正相关，提示VEGF-C能够诱导肿瘤淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管构成，而且与肿瘤的淋巴道搬运密切相关。估测肿瘤细胞可能经过发作VEGF-C并与其受体特异性结合，然后诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管重生和扩张；而肿瘤MLVD计数添加为肿瘤细胞进一步侵入微淋巴管供给了更有利的条件，然后促进肿瘤细胞的淋巴道搬运[9]。
总归，尽管有关宫颈癌淋巴道搬运的详细机制尚不彻底清楚，但肿瘤的淋巴道搬运无疑是一个涉及到多个要素的多进程、多阶段的杂乱进程。在肿瘤的淋巴道搬运进程中，瘤细胞发作的VEGF-C可能发挥了重要效果。VEGF-C可经过与其特异性的受体结合诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管构成，并进一步促进肿瘤细胞的淋巴道分散和搬运，因而，临床检测VEGF-C表达及MLVD计数可作为点评肿瘤细胞诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管构成研讨的重要目标，并有助于临床对宫颈癌医治计划的点评及预后判别。
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[4] Saptefrait L，Cǐmpean AM，Ciornǐi A，et al. Identification of lymphatic vessels and prognostic value of lymphatic microvessel density in lesions of the uterine cervix[J]. Rom J Morphol Embryol，2009，50（4）：589-594.
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[6] Gombos Z，Xu X，Chu CS，et al. Peritumoral lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor C expression in early-stage squamous cell carcinoma of the uterine cervix[J]. Clin Cancer Res，2005，11（23）：8364-8371.
[7] Watanabe S，Kato M，Kotani I，et al. Lymphatic Vessel Density and Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Squamous Cell Carcinomas of Lip and Oral Cavity：A Clinicopathological Analysis with Immunohistochemistry Using Antibodies to D2-40，VEGF-C and VEGF-D[J]. Yonago Acta Med，2013，56（1）：29-37.
[8] Botting SK，Fouad H，Elwell K，et al. Prognostic significance of peritumoral lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor receptor 3 in invasive squamous cell cervical cancer[J]. Transl Oncol，2010，3（3）：170-175.
[9] Sotiropoulou N，Bravou V，Kounelis S，et al. Tumor expression of lymphangiogenic growth factors but not lymphatic vessel density is implicated in human cervical cancer progression[J]. Pathology，2010，42（7）：629-636.
（收稿日期：2014-03-18）endprint
