金爱红 周霞平 周凤珍
[摘要] 意图 研讨CD147在子宫内膜异位细胞中的表达状况，并评论其对子宫内膜细胞的搬迁和凋亡的调理作用。 办法 选取2013年6～12月于本院进行诊治的60例子宫内膜异位症患者为试验组，并以同期的60名不孕症患者为对照组，然后取试验组的异位内膜及对照组的正常子宫内膜进行查验，以实时荧光定量PCR法进行CD147的检测，核算并比较试验组进行抗体阻断前后的HES细胞搬迁率及基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达。 成果 试验组CD147表达为（7.65±1.25），其显着高于对照组（0.95±0.14），差异有核算学含义（P<0.01）；经抗体阻断后的HES细胞搬迁率显着低于阻断前，差异有核算学含义（P<0.01），阻断前后MMP-2表达则无显着差异（P>0.05）。 定论 CD147在子宫内膜异位细胞中出现高表达状况，其经过MMP-2非依赖性途径来影响人子宫内膜上皮细胞HES的搬迁，以到达参加疾病发作、开展的作用。
[要害词] CD147；基质金属蛋白酶2；HES细胞搬迁率；子宫内膜异位症
[中图分类号] R711.71 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）06（c）-0006-05
[Abstract] Objective To study the expression situation of CD147 in endometriosis，and investigate the regulating action of CD147 for the migration and apoptosis. Methods 60 patients with endometriosis in our hospital from June to December in 2013 were chosen as the experimental group，60 patients with infertility at the same time were chosen as the control group，then the ectopic endometrium of experimental group and normal endometrium of control group were detected，CD147 were detected with PCR real-time fluorescent quantitative method，and the HES cell migration rate and MMP-2 expression of experimental group were respectively analyzed and compared before and after the blocking antibodies. Results CD147 expression of experimental group was （7.65±1.25），and it was obviously higher than that of control group （0.95±0.14），with significant difference （P<0.01），and the HES cell migration rate of experimental group after the blocking antibodies was obviously lower than that before the blocking antibodies with significant difference （P<0.01），while the MMP-2 expression before and after the blocking antibodies had no obvious difference （P>0.05）. Conclusion CD147 in endometriosis shows high expression state，and it can influence the migration of human endometrial epithelial cell HES through the MMP-2 independent pathways，in order to participate in disease progression.
[Key words] CD147；MMP-2；HES cell migration rate；Endometriosis
子宫内膜异位症是一种极为常见的妇科疾病，其在育龄妇女中的发作高达10%左右[1-3]，且其在近年来出现升高的趋势，关于本病发作开展过程中影响目标的研讨也并不罕见，其间子宫内膜异位症细胞的搬迁以及恶性侵袭行为是较受认可的一类说法。CD147是具有增强肿瘤细胞的侵袭才能的一类目标[4-7]，且其在子宫成纤维细胞中具有诱导基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达添加的作用[8-9]，可是关于其在子宫内膜异位症中的改动研讨却极为缺乏，本文中笔者就CD147在子宫内膜异位细胞中的表达状况进行研讨，并评论CD147对子宫内膜细胞的搬迁和凋亡的调理作用。
1材料与办法
1.1一般材料
选取2013年6～12月于本院进行诊治的60例子宫内膜异位症患者为试验组，并以同期的60名不孕症患者为对照组。对照组60名不孕妇女中，年纪22～42岁，均匀（32.2±5.7）岁。调查组60例子宫内膜异位症患者中，年纪21～41岁，均匀（32.5±5.6）岁；r-AFS分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期15例，Ⅲ期17例，Ⅳ期10例。两组年纪等一般材料比较，差异无核算学含义（P>0.05），具有可比性。一切患者均有规则的月经周期，且其子宫内膜安排均处于月经周期中的增殖阶段。研讨目标术前3个月未用过任何激素医治或消炎剂医治。
1.2办法
取试验组的异位内膜及对照组的正常子宫内膜进行查验，以实时荧光定量PCR法进行CD147的检测，核算并比较试验组进行抗体阻断前后的HES细胞搬迁率及MMP-2表达。
1.2.1 RNA提取和实时PCR剖析 CD147的TaqMan5引物购自Applied Biosystems公司。总RNA样品由Trizol试剂（Invitrogen公司，美国加利福尼亚州）萃取。首要，取安排50～100 mg，剪碎，参加0.5 ml Trizol试剂匀浆，移入1.5 ml离心管中，再用0.2 ml Trizol冲刷匀浆器，剧烈震动15 s，4℃离心（14 000 r/min），10 min后，将上层水相转移至1个1.5 mL的焦碳酸二乙酯处理的微量离心管中。为沉积RNA，每1毫升Trizol试剂中参加0.5 ml异丙醇，参加到上层水相样品，并在-20℃下作用10～30 min。将RNA在14 000 r/min离心10 min，取其沉积，在4℃并用1 ml 75%的乙醇洗刷1次。将适量RNA溶解在无RNase水。将RNA浓度经过S2000紫外-可见分光光度计（Perkin-Elmer公司，美国）测定，选用iScript cDNA组成试剂盒（Bio-Rad公司，美国），1 μg总RNA被转录为cDNA。进行定量PCR时，1式3份，分别在Applied Biosystems 7500Fast实时PCR体系中进行。
1.2.2免疫印迹 HES细胞在裂解缓冲液（RAPI的缓冲液：50 mmol/L pH为8.0的Tris-盐酸，150 mmol/L的NaCl，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS）中提取。免疫印迹法剖析参阅文献[10]所述进行。不同阶段的总裂解物（每泳道40 μg）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到硝酸纤维素滤膜上（Schleicher & Schuel，Dasse，德国）。在TBST（50 mmol/L的Tris-盐酸，150 mmol/L的NaCl，0.05%吐温20，5%脱脂牛奶，pH 7.6）关闭孵育。参加一抗，在TBST+1.5%无脂牛奶中孵育1 h，参加辣根过氧化物酶符号的二抗孵育1 h。将膜用TBST洗刷3次，然后经过增强的化学发光法（Amersham公司，皮斯卡塔韦，新泽西州）进行检测。
1.2.3 搬迁试验 该操作参阅文献[11]所述进行。将5×106细胞培育在6孔板中，直至单层细胞后，此刻DMEM+10%FBS培育基被替换为用DMEM+1%FBS。参加10 μg/ml的正常小鼠抗-CD147单克隆抗体作为试验组，参加10 μg/ml的小鼠IgG（Santa Cruz公司，CA，USA）作为阴性对照组。在24 h内，每间隔一段时刻就核算搬迁率，本研讨选用至少5种成像技能核算量化每板的搬迁率。
1.2.4 蛋白酶激活明胶酶谱 用抗-CD147抗体医治24 h，进行明胶酶谱剖析MMP-2的表达和活性。样品参加到含有7.5%SDS-聚丙烯酰胺和0.5%明胶的凝胶中进行电泳。凝胶完毕后，参加2.5%的Triton X-100，在室温下温育30 min，弃除Triton X -100，将胶放入含有50 mmol/L的Tris-HCl（pH为7.5，200 mmol/L的NaCl，5 mmol/L的CaCl2和0.02%Brij35），37℃孵育过夜，然后用0.5%考马斯亮蓝G染色30 min，再用脱色液（50%%甲醇和10%乙酸）室温作用30 min。明胶酶活性被可视化为蓝色布景上的白色条带，本试验重复2次。
1.2.5 HES细胞的生计/凋亡测定 参阅以往研讨，CD147能够调理精母细胞的生计/凋亡[12]。因而，在本试验中，笔者选用MTS试验研讨CD147对细胞成长的影响。参加10 μg/ml的抗CD147抗体后，调查子宫内膜细胞的活性状况及其与时刻的相关性。CD147阻断后，HES细胞的生机下降，可能原因是按捺细胞增殖或增强细胞凋亡。为了区别这两种可能性，笔者在HES细胞中参加10 μg/ml的抗CD147抗体，选用免疫印迹法测定Bax、caspase-3、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）。
1.3核算学办法
选用核算软件SPSS 16.0对试验数据进行剖析，计量材料数据以均数±标准差（x±s）标明，多组间比较选用ANOVA剖析，组间两两比较选用LSD-t查验。计数材料以率标明，选用χ2查验。以P<0.05为差异有核算学含义。
2成果
2.1 两组研讨目标内膜细胞CD147表达的比较
试验组异位内膜内CD147表达为（7.65±1.25），显着高于对照组（0.95±0.14），差异有核算学含义（P<0.01）（图1）。
2.2 试验组抗体阻断前后HES细胞搬迁率及MMP-2表达的比较
经过试验研讨比较显现，试验组经抗体阻断后的HES细胞搬迁率显着低于阻断前，差异有核算学含义（P<0.01），运用特异抗人CD147参加体外子宫内膜上皮细胞抗体阻断CD147功用，进行细胞搬迁试验，培育24 h后，参加CD147抗体后，细胞搬迁间隔为（150.9±10.0）μm，参加IgG抗体的细胞搬迁间隔为（266.8±11.5）μm，差异有核算学含义（P<0.01）（图2），而阻断前后MMP-2表达差异则无核算学含义（P>0.05）（图3），提示CD147功用的搅扰并没有改动HES细胞的MMP-2的活性。
2.3体外按捺CD147功用对HES细胞凋亡的影响
当参加10 μg/ml的抗CD147抗体后，子宫内膜细胞活性被显着按捺，而且出现时刻相关性，这标明，CD147是参加调理HES细胞的生计/凋亡（图4A）。在HES细胞加10 μg/ml的抗CD147抗体后，Bax蛋白表达、caspase-3和PARP均显着上调，而总caspase-3的表达没有显着改动。这些成果标明，CD147阻断后，HES细胞凋亡增强（图4B）。
3评论
尽管已有研讨标明CD147在子宫内膜异位症中的表达添加[13-14]，但现在尚无CD147在子宫内膜细胞中的定量研讨，且CD147在子宫内膜上皮细胞中的功用尚不清楚。在本研讨中，笔者发现CD147在60名女人卵巢子宫内膜异位病灶安排中表达显着增高，这是第1个相对较大样本量的定量研讨。此外，本研讨标明，在体外子宫内膜细胞中参加CD147抗体可按捺细胞搬迁并加强细胞凋亡，提示CD147其在子宫内膜异位症的发作开展中起了重要作用。
研讨标明，CD147的过表达能够增强肿瘤细胞的侵袭才能，在癌症的开展过程中起重要作用[15-16]。最近，还报导了精子发作中CD147可调理生殖细胞的搬迁和凋亡[17]。在女人生殖道，CD147表达在卵巢[5]、胎盘和胎膜[7]、子宫[6]。还有一些研讨现已标明，CD147表达在人子宫内膜间质和腺上皮，如Braundmeier等[8]报导CD147表达定坐落成纤维细胞和子宫内膜上皮细胞。值得注意的是，在人子宫内膜中，CD147的表达跟着月经周期的不同而表达于不同的细胞中。在月经周期的增殖期，CD147表达显着添加，提示CD147可能参加了子宫内膜细胞增殖的调控。在本试验中笔者现已证明，参加CD147抗体后，子宫内膜细胞的存活率显着下降，细胞凋亡显着添加。细胞凋亡是用于坚持安排的自我平衡状况的要害的细胞机制。越来越多的研讨标明，经过细胞凋亡，可在月经周期中消除变老的细胞，以保持子宫内膜的动态平衡。早在1998年，有学者发现在子宫内膜异位症患者中，子宫内膜细胞的凋亡削减，标明增强在位内膜细胞的存活可能添加子宫内膜异位症发病的可能性[18]。近期有研讨标明，子宫内膜异位症患者中，子宫内膜表现出较高水平的增殖活性和较低水平的凋亡相关蛋白[19]。但是，怎么导致子宫内膜细胞存活增强的机制尚不清楚。本研讨显现，CD147在卵巢子宫内膜异位安排表达显着添加，而且在子宫内膜上皮细胞中使细胞存活添加，提示CD147可能促进子宫内膜异位症的发作开展。
一些研讨现已标明，MMP-2是在子宫内膜细胞重塑过程中发挥诱导和激活的作用。最近的一项研讨标明，CD147的可溶性方式由子宫内膜上皮细胞排泄，影响子宫间质成纤维细胞排泄MMP-2[20]。此外，有学者现已证明，CD147在体外培育的牛上皮内膜细胞中，可促进MMP-2和MMP-14的表达[21]。依据基质金属蛋白酶在细胞搬迁中的作用，笔者估测CD147与细胞搬迁相关，这是子宫内膜异位症发病的要害。在本研讨中，笔者现已证明，参加CD147抗体后，子宫内膜细胞搬迁显着削减。不过MMP-2的表达和活性没有显着改动，提示CD147在子宫内膜细胞搬迁中的作用是经过其他机制介导的。子宫内膜上皮细胞排泄CD147，一方面促进子宫内膜间质细胞排泄基质金属蛋白酶；另一方面，加快细胞存活及搬迁，一起经过现在尚不清楚的机制在上皮细胞和基质细胞之间相互作用，从而在子宫内膜异位症的开展中起了要害作用。
总归，在卵巢子宫内膜异位症的开展过程中，CD147参加了细胞凋亡的调控，在卵巢子宫内膜异位症细胞凋亡和搬迁过程中起了重要作用。进一步研讨CD147在子宫内膜异位症患者子宫内膜的表达，可能会更好地说明其分子发病机制，并有助于评价子宫内膜异位症的医治作用。
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（收稿日期：2015-02-05 本文修改：卫 轲）
