翁琴云+++游小伟+++张建梅+++黄建炜
[摘要] 意图 树立厦门市副溶血性弧菌别离株的脉冲场凝胶电泳（PFGE）数据库，剖析不同来历菌株的同源性联系。 办法 203株菌株的基因组DNA经SfiⅠ酶切、脉冲场电泳后，运用Bionumerics软件剖析电泳图谱。 成果 203株菌株可分红149种不同的PFGE型，91.13%（185株）的菌株具有共同的带型，一同也有少量带型包括的菌株数较多。关于日常监测中别离得到的菌株，PFGE分型成果与水产品的品种、采样时刻基本无相关性，79个菌株可分红74个PFGE带型；从历年食物中毒应急监测中别离得到的菌株，其PFGE型相对较少，124株中只要76个PFGE型。运用Bionumerics核算D值为99.81%。 定论 树立了厦门市副溶血性弧菌的PFGE数据库，为本市副溶血性弧菌的监测和疫情的应急处理供给了科学依据。
[关键词] 副溶血性弧菌；脉冲场凝胶电泳；分子分型
[中图分类号] R378.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）08（a）-0007-04
Molecular analysis and database establishment of Vibrio parahaemolyticus by pulsed field gel electrophoresis in Xiamen
WENG Qin-yun YOU Xiao-wei ZHANG Jian-mei HUANG Jian-wei
Center for Disease Control and Prevention of Xiamen City，Xiamen 361021，China
[Abstract] Objective To establish pulsed field gel electrophoresis（PFGE）database of Vibrio parahaemolyticus and to analyse the homology during the strains from different sources. Methods The DNA samples of 203 Vibrio parahaemolyticus strains were digested with SfiⅠand then were analyzed by PFGE and bionumerics software. Results 203 strains were divided into 149 distinctive PFGE patterns 91.13% （185 strains） of strains owned unique PFGE pattern，and a few of strains owned more strains.79 strains from surveillance were divided into 74 PFGE patterns，which indicated that there was no relationship between the typing results and aquatic product，sampling time.124 strains from food poisoning were divided into 76 PFGE patterns.The D value was 99.81% calculated by bionumerics software. Conclusion The PFGE database of Vibrio parahaemolyticus in Xiamen is established，which providing scientific basis for surveillance and emergency response of Vibrio parahaemolyticus in the city.
[Key words] Vibrio parahaemolyticus；Pulsed field gel electrophoresis；Molecular typing
副溶血性弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性弧菌，广泛存在于海水和海产品中，进食含有该菌的食物，可引起严峻的胃肠炎反响[1]，现在是我国滨海区域常见的食物中毒病原菌。脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）技能是一种非常重要且运用广泛的分子分型技能，可用于点评副溶血性弧菌菌株之间的遗传多样性及来历于环境的菌株与别离自患者菌株的相关性[2-3]。厦门地处滨海，在食源性致病菌日常监测中经常可从外环境各种水体和水产品中别离到副溶血性弧菌菌株，一同在本地爆发的多起食物中毒应急检测中别离得到副溶血性弧菌菌株。本项目选用PFGE技能对本试验室历年从日常检测与食物中毒应急事情中别离得到的203株副溶血性弧菌菌株进行剖析研讨，树立厦门市副溶血性弧菌PFGE数据库，有利于从分子水平上了解本市副溶血性弧菌的环境菌株与别离自患者菌株的特征及其相互联系。
1 材料与办法
1.1 菌株
2005年5月～2012年11月本试验室在日常监测及食物中毒中别离得到的203株副溶血性弧菌别离株，其间有79株是在日常监测中别离得到，别的124株是在历年的食物中毒应急检测中别离得到。
1.2 首要试剂和仪器
蛋白酶K（Merck公司）；脉冲场电泳级琼脂糖SeaKem Gold Agarose（Lonza公司）；限制性内切酶：SfiⅠ、XbaⅠ（NEB公司）；脉冲场电泳仪为CHEF MAPPER（Bio-Rad公司）；Densimat细菌浊度仪（BioMerieux公司）；凝胶成像仪为Gel Doc XR+（Bio-Rad公司）。
1.3 试验办法
依据PulseNet网络试验室引荐的规范办法进行PFGE试验。
1.3.1 胶块制备 从检测培育基上挑取单菌落，无菌接种于3% TSA平板上，37℃培育14～18 h。从培育皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于细胞悬浮液（CSB）中于浊度仪上调整细菌的浓度，使OD值为4～4.5。取400 ml菌悬液参加终浓度为0.5 mg/ml蛋白酶K进行消化，再参加等体积1% SeaKem Gold Agarose，混匀灌制胶块。
1.3.2 细胞裂解和胶块的洗刷 凝结后胶块参加细胞裂解液（CLB）/蛋白酶K混合液，置于54℃水浴轻摇2 h后，用50℃预热的灭菌超纯水洗刷2次，再用50℃预热TE缓冲液洗刷4次。
1.3.3 胶块DNA酶切 切取2 mm宽的副溶血性弧菌胶块，用SfiⅠ酶处理，于50℃酶消化4 h，沙门菌H9812用XbaⅠ酶切，于37℃酶消化4 h。
1.3.4 加样和电泳 将酶切后的胶块直接粘在梳子齿上，向胶槽中注入100 ml溶化的1% SeaKem Gold Agarose，待胶凝结后进行电泳。设置电泳缓冲液的温度为14℃，电泳参数：78～396 kb、10～35.3 s、19 h。
1.3.5 图画获取及数据剖析 电泳完毕后，将胶放入Gelred染猜中染色，脱色后用Gel Doc XR+成像，运用BioNumerics（6.6.4）软件，挑选Dice相联系数和UPGMA办法，设置tolerance为1.5%，对PFGE图谱进行处理和聚类剖析。一同，运用Simpson差异指数（D值）对PFGE分型成果进行点评。本试验中的菌株带型均依照世界PulseNet的带型命名准则进行命名。
2 成果
2.1 PFGE分型成果
203株副溶血性弧菌经过PFGE剖析，取得149个不同的PFGE带型，命名为VPAS12.XM0001～VPAS 12.XM0149。图1是每个PFGE型各选取1个代表株的聚类图，可看出DNA条带分子量首要集中于30～700 kb，酶切条带数为14～21。优势型别有VPAS12.XM0105，共含有14个菌株；VPAS12.XM0124含有8个菌株；VPAS12.XM0113、VPAS12.XM0121、VPAS12.XM0125，都含有6个菌株；VPAS12.XM011有4个菌株。优势型别所含有的绝大多数菌株都是从食物中毒应急检测中别离得到，只要VPAS12.XM0105中有1个菌株来历于日常监测。运用Bionumerics核算D值为99.81%。
2.2 对厦门副溶血性弧菌的PFGE数据库整体描绘
将本试验中所取得的203株副溶血性弧菌的PFGE图谱，悉数录入Bionumerics软件中，树立了厦门市副溶血性弧菌的PFGE数据库。整个数据库共包括79株从日常监测中别离得到菌株及124株从历年食物中毒应急检测中别离得到的菌株，共取得149个PFGE型别，其间91.13%（185株）的菌株具有共同的带型，一同也有少量带型包括的菌株数较多，含有最多菌株（14株）的优势型别只要VPAS12.XM0105（图2）。
图2 各种PFGE带型包括的菌株数散布状况
从菌株来历看，关于日常监测中别离得到的菌株，PFGE分型成果与水产品的品种、采样时刻基本无相关性，79个菌株可分红74个PFGE带型，各带型包括的菌株数最多3个菌株。关于从历年食物中毒应急监测中别离得到的菌株，其PFGE型相对较少，124株中只要76个PFGE型，各带型包括的菌株数最多13个菌株（表1）。
表1 副溶血性弧菌2种不同来历的菌株PFGE带型的状况描绘
3 评论
运用传统的血清型分型和噬菌体分型办法对副溶血性弧菌进行分型，只能进行表型判定，存在分辨力、灵敏度不高级许多缺点[4]，PFGE分型办法是一种根据基因水平的分子分型办法，因其具有高分辨力、可重复性、稳定性等特色，现在已成为分子分型的“金规范”。1996年在美国首要建立的PulseNet网络就是运用规范化的分子分型技能（PFGE技能是其间最重要的办法之一），经过菌株“指纹图谱”或序列材料的比对剖析，辨认流行症病例间的内涵遗传相关，进而追溯流行症爆发来历和传达途径[5]。美国PulseNet建立之后，屡次对以食源性病原体为主的细菌进行监测，且在屡次食物中毒的查询中发挥了杰出效果[6-8]。PulseNet China自2004年建立之后，也先后参加国内外多个疫情的协查与处理[6]，因而，本研讨在防备和操控突发食源性疾病公共卫生事情中含义严重。
本项目中203株菌株可分红149种不同的PFGE型，91.13%（185株）的菌株具有共同的带型，一同也有少量带型包括的菌株数较多，但包括最多的优势型别VPAS12.XM0105，也只含有14个菌株，其间只要1个菌株是来历于日常监测。79个菌株可分红74个PFGE带型，各带型包括的菌株数最多3个菌株。很多型别的呈现，说明晰从日常监测中得到的厦门区域副溶血性弧菌菌株存在遗传多样性，并且变异度较大，与相关报导成果共同[2，9-10]。单个菌株间存在同源性，其间FJXM11VPA004和FJXM11VPA006图谱完全相同，归于同一个带型，命名为VPAS12.XM0096。这两个菌株采样时刻、采样地址、采样品种都不相同，提示可能有相同的污染来历，所以仍应加强对副溶血性弧菌的日常监测，然后有用防备食源性疾病的发作。关于从历年食物中毒应急监测中别离得到的124株菌株，其聚类剖析成果标明，各个菌株之间的类似度较高，总的可分红76个PFGE型，同一次食物中毒应急检测中别离得到的菌株，其指纹图谱大多数共同或高度类似，但也有的指纹图谱相差较大，这与食物中毒是由单一血清型感染或多血清感染具有很大联系。研讨标明，食物中毒中同一患者别离到多种血清型，不同患者别离到不同种血清型[11-12]或剩下食物和患者能够别离到不同血清型的副溶血性弧菌均有可能[13-14]。
从菌株来历来看，79株从日常监测中别离得到的菌株与124株从历年食物中毒事情中别离得到的菌株，两者的菌株指纹图谱整体上存在明显差异，只要1个从日常监测中别离得到的菌株与食物中毒的菌株共同，可见，这些在日常监测中别离得到的副溶血性弧菌与本地爆发的疫情无关。
[参考文献]
[1] Wong HC，Lin CH.Evaluation of typing of Vibrio parahaemolyticus by three PCR methods using specific primers[J].J Clin Microbiol，2001，39（12）：4233-4240.
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[3] Ottaviani D，Leoni F，Rocchegiani E，et al.Vibrio parahaemolyticus-associated gastroenteritis in Italy：persistent occurrence of O3∶K6 pandemic clone and emergence of O1∶KUT serotype[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2010，66（4）：452-455.
[4] 方伟，杨杏芬，柯昌文.副溶血性弧菌分型研讨进展[J].疾病防控杂志，2008，12（5）：468-472.
[5] 李伟，崔志刚，阚飙，等.转化防备医学的实践：PulseNet-China[J].疾病监测，2012，27（2）：88-92.
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[8] Gerner-Smidt P，Hise K，Kincaid J，et al.PulseNet USA：a five-year update[J].Foodborne Pathog Dis，2006，3（1）：9-19.
[9] 侯凤伶，刘维华，申志新，等.副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳分型研讨[J].有用防备医学，2008，15（1）：34-37.
[10] Wong HC，Liu SH，Chiou CS，et al.A pulsed-field gel electrophoresis typing scheme for Vibrio parahaemolyticus isolates from fifteen countries[J].Int J Food Microbiol，2007，114（3）：280-287.
[11] 黄锐敏，俞慕华，鞠长燕.一同副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学剖析[J].河南防备医学杂志，2011，22（2）：151-152.
[12] 方叶珍，黄世旺，罗芸，等.一同两种血清型副溶血性弧菌食物中毒的毒力基因及分子分型研讨[J].我国卫生查验杂志，2012，22（1）：96-98.
[13] 林秋云，曾树权，尹映华，等.一同副溶血性弧菌引起食物中毒的试验室检测[J].我国微生态学杂志，2012，24（2）：178-180.
[14] 邓冬云，梁景涛，杨启，等.多型别副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学剖析[J].我国卫生查验杂志，2012，22（4）：776-778.
（收稿日期：2014-05-07 本文修改：李亚聪）
从菌株来历来看，79株从日常监测中别离得到的菌株与124株从历年食物中毒事情中别离得到的菌株，两者的菌株指纹图谱整体上存在明显差异，只要1个从日常监测中别离得到的菌株与食物中毒的菌株共同，可见，这些在日常监测中别离得到的副溶血性弧菌与本地爆发的疫情无关。
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[14] 邓冬云，梁景涛，杨启，等.多型别副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学剖析[J].我国卫生查验杂志，2012，22（4）：776-778.
（收稿日期：2014-05-07 本文修改：李亚聪）
从菌株来历来看，79株从日常监测中别离得到的菌株与124株从历年食物中毒事情中别离得到的菌株，两者的菌株指纹图谱整体上存在明显差异，只要1个从日常监测中别离得到的菌株与食物中毒的菌株共同，可见，这些在日常监测中别离得到的副溶血性弧菌与本地爆发的疫情无关。
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（收稿日期：2014-05-07 本文修改：李亚聪）
