贾黎++++崔军
[摘要] 意图 评论体外共培育软骨细胞与脂肪基质细胞（ADSCs）用于软骨构建的可行性。 办法 别离搜集并培育人ADSCs与猪耳软骨细胞，设置试验组、阳性对照组、阴性对照组，别离接种ADSCs和软骨细胞（以7∶3份额混合）、单纯软骨细胞、单纯ADSCs，调查并比照三组的形态学改变、湿重、蛋白多糖含量、安排学特征及Ⅱ型胶原的表达状况。 成果 经过8周的体外培育，试验组安排形状规矩，表现出软骨安排的结构特征，且有必定的弹性；关于均匀湿重及蛋白多糖定量检测发现，试验组的均匀湿重可达阳性对照组的73.1%、81.9%，与阴性对照组比较差异有统计学含义（P<0.01）；HE染色显现试验组标本呈现接连的软骨样安排，发生老练的软骨陷窝及纤维性安排，重生软骨厚度较为显着，Ⅱ型胶原免疫组化染色发现，试验组软骨陷窝邻近多处呈棕黄色，呈阳性反应。定论 软骨细胞及ADSCs体外共培育可用于软骨安排的构建，还需进一步研讨断定ADSCs转化为老练软骨细胞的直接依据。
[关键词] 软骨细胞；脂肪基质细胞；共培育；软骨构建
[中图分类号] R321[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）06（c）-0012-04
Experimental study of in vitro co-culture of chondrocytes and adipose-derived stromal cells for cartilage construction
JIA Li CUI Jun
Department of Stomatology,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518000,China
[Abstract] Objective To investigate the feasibility of in vitro co-culture of chondrocytes and adipose-derived stromal cells (ADSCs) for cartilage construction. Methods ADSCs and porcine auricular chomdrocytes were collected and cultured in vitro,and then three groups were set as the experimental group,the positive control group and the negative control group,which were inoculated ADSCs and chondrocytes(7∶3 mixing ratio),simple chondrocytes,simply ADSCs respectively.And the contrast morphological changes,the wet weight,the proteoglycan content changes and type Ⅱ collagen in the expression of histological feature of the three groups was observed and analyzed respectively. Results After eight weeks in vitro culture,the tissue of experimental group had a regular shape,which looked like the structure of cartilage tissue and was certain flexibility.For detection ofthe average wet weight and proteoglycan quantitative,the average wet weight and proteoglycan could reach 73.1%,81.9% of that in the positive experimental group respectively,which were significantly higher than that in the negative control group(P<0.01).HE staining showed that the experimental group occurred consecutive cartilage-like tissue,mature cartilage and fibrous tissue,and new cartilage thickness was more obvious.Type Ⅱ collagen immunohistochemical staining found that brownish yellow occurred near lacunas of cartilage in the experimental group. Conclusion Chondrocytes and ADSCs co-culture in vitro can be used to build cartilage,but further research is need to determine the direct evidence of ADSCs converted to mature chondrocytes.
[Key words] Chondrocytes;Adipose-derived stromal cells;Co-culture;Cartilage construction
近年来，跟着细胞生物学和生物资料研讨的不断发展，安排工程学逐步成为新式的学科，其使用生物资料为载体将种子细胞置入体内，并发生有功用安排，为安排损害的修正供给新的思路和办法[1]。软骨损害是临床较为常见的病症，一起自我修正才能有限，往往导致关节痛苦、行走困难等不适，影响患者的日子质量。现在，骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）诱导分解为软骨细胞的研讨较多，但因为BMSCs的来历有限，大大约束了临床使用[2-3]。脂肪基质细胞（adipose-derived stromal cells，ADSCs）是一类与BMSCs有相同表型特征和生物学特性且可多向分解的干细胞，因其散布规模广泛，体外增殖较快，逐步成为新的骨安排工程种子细胞。多项研讨显现，与BMSCs比较，ADSCs的成软骨分解才能较弱[4]，因而，怎么诱导ADSCs的成软骨分解及坚持其安稳表达软骨表型成为临床亟待解决的问题。一般关于诱导ADSCs的成软骨分解往往经过添加很多的成长因子等进行，但本钱高，体内诱导效果差[5]。国外研讨发现，选用软骨细胞与BMSCs共培育诱导成软骨分解，成功构建软骨安排[6]。本研讨选用软骨细胞与ADSCs共培育办法进行成软骨分解诱导，调查其体外构建老练软骨安排的才能，探求体外共培育软骨细胞与ADSCs构建软骨安排的可行性。
1 资料与办法
1.1 仪器与试剂
DMEM培育基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液由美国Hyclone公司出产；BGJb培育基、Ⅰ型胶原酶由美国Gibco公司出产；Ⅱ型胶原购自美国Invitrogen公司；聚羟基乙酸、聚乳酸购自美国Sigma公司；离心设备选用德国Eppendorf 5810R台式高速离心机；CO2恒温培育箱购自美国Thermo Fisher公司。
1.2 ADSCs的别离和培育
脂肪来历于行吸脂手术的健康成人16例，年纪27~38岁，均匀（32.7±6.2）岁；抽脂部位包含腰部、腹部及大腿部；一切行抽脂术者均无流行症及内排泄体系疾病。取获取的皮下脂肪50 ml置于超净工作台，选用含有1000 U/L青霉素和链霉素的PBS重复冲刷，以除掉血细胞及麻醉药物，0.075%的Ⅰ型胶原酶处理，37℃振动消化60 min，300×g离心10 min搜集基层沉积细胞，并除掉悬浮的脂肪细胞及脂滴，取BGJb培育基重悬细胞，并以3500/ml浓度接种于25 cm2培育瓶，37℃、5%CO2、饱和湿度下培育，间日换液，至细胞成长至培育瓶的80%～90%时进行传代。
1.3 软骨细胞的别离和培育
软骨细胞取自猪耳廓部位，详细操作如下：无菌切取部分猪耳廓，除掉皮肤及软骨膜，选用眼科剪将其剪成3 mm×3 mm的片状；参加0.2%Ⅱ型胶原酶消化处理过夜，至有单个细胞游离后，参加DMEM培育液停止消化；选用移液器悄悄吹打，别离细胞团，选用200目滤网过滤，搜集滤液；1500 r/min离心5 min，搜集沉积，选用含10%胎牛血清的DMEM培育液重悬细胞，并以2.0×104/cm2的密度接种，37℃、5%CO2、饱和湿度下培育，间日换液，至细胞成长近集合后，消化并搜集细胞备用[7]。
1.4 PGA/PLA复合生物资料的制备[8]
称取聚羟基乙酸（PGA）15 mg嵌入圆柱状硅胶模具（直径8 mm，高2 mm），选用二氯甲烷制备0.1%的聚乳酸（PLA）溶液，取0.5 ml滴加至嵌入PGA的硅胶模具内，待其天然晒干，置于75%乙醇内浸泡消毒30 min，后选用PBS重复冲刷，以保证除净酒精，吸干备用。
1.5 试验分组与体外培育
本试验共设置3组，别离为试验组、阳性对照组、阴性对照组，每组设置6例标本，其间试验组选用软骨细胞与ADSCs共培育，两者依照3∶7的份额混合，接种200 μl浓度为5.0×107/ml的混合细胞悬液于预制的PGA/PLA支架上；阳性对照组及阴性对照组依照相同的接种量别离接种单纯软骨细胞及单纯ADSCs。将接种好的PGA/PLA支架于37℃、5%CO2、饱和湿度下体外培育8周，选材检测。
1.6 体外诱导培育的检测
1.6.1 形态学调查调查内容包含各组细胞-资料复合物经体外培育后的巨细、形状、色泽等，并比照剖析各组间的差异。
1.6.2 湿重及蛋白多糖定量检测别离测定各组标本的湿重及蛋白多糖含量，其间蛋白多糖的定量测定选用阿利辛蓝法[9]进行，比照剖析各组间的差异。
1.6.3 HE染色检测将培育8周后的安排选用10%福尔马林溶液固定，制造白腊切片，行HE染色，调查细胞-资料复合物的安排结构，如安排接连性、软骨陷窝构成及生物资料的降解状况等。
1.6.4 Ⅱ型胶原表达的免疫组化检测同上，制造白腊切片，试验操作依照白腊切片的免疫组化办法进行，包含烘片、脱蜡、复水、漂洗、关闭等进程，参加抗Ⅱ型胶原单克隆抗体（鼠抗人，英国Abcam公司），4℃孵育过夜，后选用PBS漂洗3次，参加生物素化的二抗（羊抗鼠，英国Abcam公司）孵育，后进行DAB显色及HE染色，并封片镜检，于荧光显微镜下调查Ⅱ型胶原表达状况。
1.7 统计学处理
选用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计量资料以x±s标明，选用F查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 形态学调查成果
经过8周的体外培育，试验组及阳性对照组的安排形状规矩，表现出软骨安排的结构特征，有必定的弹性，其直径及厚度较PGA/PLA支架无显着改变，而阴性对照组未表现出软骨安排特征，细胞-资料复合物结构松懈，呈现舒展变形。
2.2 3组湿重及蛋白多糖含量的比较
试验组及阳性对照组的均匀湿重大于阴性对照组，均匀蛋白多糖含量高于阴性对照组，差异有统计学含义（P<0.01）（表1）。
表1 3组湿重及蛋白多糖含量的比较（x±s）
与阴性对照组比较，*P<0.01
2.3 各组HE染色及免疫组化成果
HE染色成果显现，试验组呈现接连的软骨样安排，老练的软骨陷窝及纤维性安排发生，仍残留少数PGA纤维，标本内部呈现必定程度的松懈，但重生软骨厚度较显着；阳性对照组多为均一的老练软骨安排，仅在中心方位处呈现结构松懈；阴性对照组标本未呈现老练软骨陷窝，以纤维性安排为主。经过免疫组化染色调查Ⅱ型胶原的表达状况发现，试验组及阳性对照组的软骨陷窝处呈阳性反应，呈现棕黄色，标明软骨细胞与ADSCs共培育成功诱导ADSCs向软骨细胞分解，而单纯接种ADSCs的阴性对照组未呈现阳性反应，无Ⅱ型胶原表达（图1）。
图1 各组HE染色及免疫组化成果
a、d.试验组，b、e.阳性对照组，c、f.阴性对照组；a～c为HE染色成果，d～f为免疫组化成果
3 评论
现在，ADSCs的多向分解潜能被广泛知道，因为其来历广泛，便于选材，且增殖活性高，逐步替代BMSCs成为骨安排工程的种子细胞。在对软骨安排损害修正的试验中，多项研讨显现ADSCs诱导向软骨细胞分解的活性较BMSCs低，一起关于诱导条件（如成长因子、血清、氧分压等）要求较高，单纯选用ADSCs构建软骨安排并不能获得抱负的效果[10]。近年来，有研讨选用软骨细胞与BMSCs共培育，可以有效地诱导BMSCs向软骨细胞分解，标明软骨细胞的存在可以为BMSCs的定向诱导供给适合的微环境[11]。鉴于ADSCs与BMSCs的结构和功用的相似性，本研讨经过体外共培育软骨细胞与ADSCs，调查其软骨安排定向诱导的效果，成果发现，经过8周的体外培育，试验组安排形状规矩，表现出软骨安排的结构特征，且有必定的弹性；关于均匀湿重及蛋白多糖定量检测发现，试验组的均匀湿重可达阳性对照组的73.1%、81.9%，一起与阴性对照组比较差异有统计学含义；HE染色显现试验组标本呈现接连的软骨样安排，发生老练的软骨陷窝及纤维性安排，重生软骨厚度较为显着，Ⅱ型胶原免疫组化染色发现，试验组软骨陷窝邻近多处呈棕黄色，呈阳性反应，标明软骨细胞与ADSCs共培育可以成功诱导ADSCs向软骨细胞分解。
关于软骨细胞怎么诱导ADSCs定向分解的机制，可能原因如下：①软骨细胞的存在，可以排泄多种成长因子[12-13]，包含TGF-β、IGF1等，然后促进ADSCs的定向分解；②软骨细胞外表表达的整合素及细胞外基质如Ⅱ型胶原等，构成软骨微环境，激活相关细胞信号通路，然后在ADSCs的定向分解中发挥效果[14]。现在详细机制尚不清晰，还需进一步深入研讨。本研讨选用PGA/PLA支架进行体外培育，首要是为了添加软骨细胞与ADSCs间的触摸然后更好地发挥其诱导效果，一起便于软骨安排均匀成长。关于软骨细胞与ADSCs的份额选取，学习有关BMSCs与软骨细胞体外共培育的报导[15-16]，一起考虑ADSCs定向诱导成软骨分解的才能，选取以软骨细胞∶ADSCs=3∶7的份额混合，但其是否是最佳的诱导份额还需后续试验进一步探究。
综上所述，软骨细胞及ADSCs体外共培育可用于软骨安排的构建，但因共培育体系中含有30%的软骨细胞，尚不足以清晰证明ADSCs确实转化为老练的软骨细胞，后续试验中可选用荧光符号的ADSCs进行诱导，经过示踪其诱导分解进程，然后为ADSCs与软骨细胞共培育成功诱导ADSCs定向分解为软骨细胞供给直接依据。
[参考文献]
[1]吕晓杰，周广东，刘霞，等.软骨细胞与脂肪基质细胞共培育体外构建软骨的开始研讨[J].中华整形外科杂志，2012，28（1）：49-54.
[2]郭敦明，曹晓建，王芳，等.骨髓间质干细胞向软骨细胞定向分解进程中基因表达谱改变[J].中华试验外科杂志，2013，30（7）：1369-1373.
[3]孙明林，吕丹，朱雷，等.共培育体系下软骨细胞对骨髓间质干细胞向软骨细胞分解的诱导效果[J].中华骨科杂志，2011，31（9）：976-982.
[4]李宝军，邓展生，高嵩涛，等.脂肪干细胞向软骨细胞诱导分解才能的研讨[J].我国现代医学杂志，2010，20（4）：505-509，514.
[5]陆伟，冀堃.脂肪安排来历干细胞的研讨进展[J].中华临床医生杂志·电子版，2013，7（20）：9332-9335.
[6]冯均伟，王跃，吕波，等.骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态调查[J].我国安排工程研讨，2013，17（36）：6409-6416.
[7]聂芳香，潘柏林，李健宁，等.软骨微粒脱细胞基质和纤维蛋白凝胶支架皮下构建安排工程软骨[J].安排工程与重建外科杂志，2010，6（1）：5-8.
[8]梁耀中，查振刚，郑力恒，等.BMSCs与PLGA支架构建安排工程化骨软骨复合安排[J].暨南大学学报·天然科学与医学版，2010，31（2）：168-173.
[9]Bjornsson S.Simultaneous preparation and quantitation of proteoglycans by precipitation with alcian blue[J].Anal Biochem，1993，210（2）：282-291.
[10]梁笃，樊粤光，王海彬，等.成人脂肪来历干细胞定向诱导分解为软骨细胞的试验研讨[J].广州中医药大学学报，2009，26（4）：412-416，428.
[11]杨宏辉，蒲晓群，高传玉，等.人骨髓间质干细胞别离、培育、分解和判定办法的研讨[J].我国老年学杂志，2009， 29（19）：2491-2493.
[12]王洪林，闵繁红，王岩峰，等.TGF-β1基因修饰诱导脂肪干细胞成软骨分解的试验研讨[J].我国矫形外科杂志，2008，16（17）：1347-1350.
[13]周全，邓展生，朱勇，等.胰岛素样成长因子1对人脂肪来历的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分解的效果[J].我国安排工程研讨与临床恢复，2010，14（10）：1785-1790.
[14]李鹏，夏亚一.整合素介导的软骨细胞力学信号转导与基因表达[J].世界骨科学杂志，2009，30（3）：158-161.
[15]苗春雷，段鹏，牟少春，等.软骨细胞与骨髓基质细胞共培育体外构建软骨安排的试验研讨[J].中华整形外科杂志，2011，27（2）：113-118.
[16]康宁，刘霞，曹谊林，等.猪耳廓及关节来历软骨细胞构建安排工程软骨的试验研讨[J].中华整形外科杂志，2014， 30（1）：33-40.
（收稿日期：2014-03-09本文修改：李亚聪）
综上所述，软骨细胞及ADSCs体外共培育可用于软骨安排的构建，但因共培育体系中含有30%的软骨细胞，尚不足以清晰证明ADSCs确实转化为老练的软骨细胞，后续试验中可选用荧光符号的ADSCs进行诱导，经过示踪其诱导分解进程，然后为ADSCs与软骨细胞共培育成功诱导ADSCs定向分解为软骨细胞供给直接依据。
[参考文献]
[1]吕晓杰，周广东，刘霞，等.软骨细胞与脂肪基质细胞共培育体外构建软骨的开始研讨[J].中华整形外科杂志，2012，28（1）：49-54.
[2]郭敦明，曹晓建，王芳，等.骨髓间质干细胞向软骨细胞定向分解进程中基因表达谱改变[J].中华试验外科杂志，2013，30（7）：1369-1373.
[3]孙明林，吕丹，朱雷，等.共培育体系下软骨细胞对骨髓间质干细胞向软骨细胞分解的诱导效果[J].中华骨科杂志，2011，31（9）：976-982.
[4]李宝军，邓展生，高嵩涛，等.脂肪干细胞向软骨细胞诱导分解才能的研讨[J].我国现代医学杂志，2010，20（4）：505-509，514.
[5]陆伟，冀堃.脂肪安排来历干细胞的研讨进展[J].中华临床医生杂志·电子版，2013，7（20）：9332-9335.
[6]冯均伟，王跃，吕波，等.骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态调查[J].我国安排工程研讨，2013，17（36）：6409-6416.
[7]聂芳香，潘柏林，李健宁，等.软骨微粒脱细胞基质和纤维蛋白凝胶支架皮下构建安排工程软骨[J].安排工程与重建外科杂志，2010，6（1）：5-8.
[8]梁耀中，查振刚，郑力恒，等.BMSCs与PLGA支架构建安排工程化骨软骨复合安排[J].暨南大学学报·天然科学与医学版，2010，31（2）：168-173.
[9]Bjornsson S.Simultaneous preparation and quantitation of proteoglycans by precipitation with alcian blue[J].Anal Biochem，1993，210（2）：282-291.
[10]梁笃，樊粤光，王海彬，等.成人脂肪来历干细胞定向诱导分解为软骨细胞的试验研讨[J].广州中医药大学学报，2009，26（4）：412-416，428.
[11]杨宏辉，蒲晓群，高传玉，等.人骨髓间质干细胞别离、培育、分解和判定办法的研讨[J].我国老年学杂志，2009， 29（19）：2491-2493.
[12]王洪林，闵繁红，王岩峰，等.TGF-β1基因修饰诱导脂肪干细胞成软骨分解的试验研讨[J].我国矫形外科杂志，2008，16（17）：1347-1350.
[13]周全，邓展生，朱勇，等.胰岛素样成长因子1对人脂肪来历的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分解的效果[J].我国安排工程研讨与临床恢复，2010，14（10）：1785-1790.
[14]李鹏，夏亚一.整合素介导的软骨细胞力学信号转导与基因表达[J].世界骨科学杂志，2009，30（3）：158-161.
[15]苗春雷，段鹏，牟少春，等.软骨细胞与骨髓基质细胞共培育体外构建软骨安排的试验研讨[J].中华整形外科杂志，2011，27（2）：113-118.
[16]康宁，刘霞，曹谊林，等.猪耳廓及关节来历软骨细胞构建安排工程软骨的试验研讨[J].中华整形外科杂志，2014， 30（1）：33-40.
（收稿日期：2014-03-09本文修改：李亚聪）
综上所述，软骨细胞及ADSCs体外共培育可用于软骨安排的构建，但因共培育体系中含有30%的软骨细胞，尚不足以清晰证明ADSCs确实转化为老练的软骨细胞，后续试验中可选用荧光符号的ADSCs进行诱导，经过示踪其诱导分解进程，然后为ADSCs与软骨细胞共培育成功诱导ADSCs定向分解为软骨细胞供给直接依据。
[参考文献]
[1]吕晓杰，周广东，刘霞，等.软骨细胞与脂肪基质细胞共培育体外构建软骨的开始研讨[J].中华整形外科杂志，2012，28（1）：49-54.
[2]郭敦明，曹晓建，王芳，等.骨髓间质干细胞向软骨细胞定向分解进程中基因表达谱改变[J].中华试验外科杂志，2013，30（7）：1369-1373.
[3]孙明林，吕丹，朱雷，等.共培育体系下软骨细胞对骨髓间质干细胞向软骨细胞分解的诱导效果[J].中华骨科杂志，2011，31（9）：976-982.
[4]李宝军，邓展生，高嵩涛，等.脂肪干细胞向软骨细胞诱导分解才能的研讨[J].我国现代医学杂志，2010，20（4）：505-509，514.
[5]陆伟，冀堃.脂肪安排来历干细胞的研讨进展[J].中华临床医生杂志·电子版，2013，7（20）：9332-9335.
[6]冯均伟，王跃，吕波，等.骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态调查[J].我国安排工程研讨，2013，17（36）：6409-6416.
[7]聂芳香，潘柏林，李健宁，等.软骨微粒脱细胞基质和纤维蛋白凝胶支架皮下构建安排工程软骨[J].安排工程与重建外科杂志，2010，6（1）：5-8.
[8]梁耀中，查振刚，郑力恒，等.BMSCs与PLGA支架构建安排工程化骨软骨复合安排[J].暨南大学学报·天然科学与医学版，2010，31（2）：168-173.
[9]Bjornsson S.Simultaneous preparation and quantitation of proteoglycans by precipitation with alcian blue[J].Anal Biochem，1993，210（2）：282-291.
[10]梁笃，樊粤光，王海彬，等.成人脂肪来历干细胞定向诱导分解为软骨细胞的试验研讨[J].广州中医药大学学报，2009，26（4）：412-416，428.
[11]杨宏辉，蒲晓群，高传玉，等.人骨髓间质干细胞别离、培育、分解和判定办法的研讨[J].我国老年学杂志，2009， 29（19）：2491-2493.
[12]王洪林，闵繁红，王岩峰，等.TGF-β1基因修饰诱导脂肪干细胞成软骨分解的试验研讨[J].我国矫形外科杂志，2008，16（17）：1347-1350.
[13]周全，邓展生，朱勇，等.胰岛素样成长因子1对人脂肪来历的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分解的效果[J].我国安排工程研讨与临床恢复，2010，14（10）：1785-1790.
[14]李鹏，夏亚一.整合素介导的软骨细胞力学信号转导与基因表达[J].世界骨科学杂志，2009，30（3）：158-161.
[15]苗春雷，段鹏，牟少春，等.软骨细胞与骨髓基质细胞共培育体外构建软骨安排的试验研讨[J].中华整形外科杂志，2011，27（2）：113-118.
[16]康宁，刘霞，曹谊林，等.猪耳廓及关节来历软骨细胞构建安排工程软骨的试验研讨[J].中华整形外科杂志，2014， 30（1）：33-40.
（收稿日期：2014-03-09本文修改：李亚聪）
