毛镇伟 满昌峰 彭辉勇 范钰
[摘要]意图调查榄香烯乳对人大肠癌细胞搬迁、侵袭的影响，并评论其可能机制。办法选用不同浓度的榄香烯乳处理人大肠癌HCT116细胞后，以划痕试验办法检测癌细胞搬迁才干，以Transwell办法检测癌细胞侵袭才干，选用荧光实时定量PCR办法检测癌细胞miR-155mRNA水平。成果人大肠癌HCT116细胞经榄香烯乳处理后，搬迁和侵袭力均显着下降，且呈剂量依赖性（P<0.05）。榄香烯乳处理组miR-155mRNA水平显着下调，且呈浓度依赖性。定论榄香烯乳可下降人大肠癌细胞侵袭才干，下调miR-155mRNA表达是其重要机制之一。
[关键词]大肠肿瘤；榄香烯乳；侵袭力；miR-155
[中图分类号]R735.3+4 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2012）12（a）-0007-03
近年来，国内大肠癌发病率逐步增高，寻觅有用的医治药物和医治手法乃燃眉之急。榄香烯乳（elemene）是从中药温莪术提取的有用成分之一，临床运用已显现其具有较广泛的抗癌谱[1-5]。可是榄香烯乳调控癌细胞侵袭的分子机制尚不彻底清楚。本课题组以大肠癌HCT-116细胞为模型，评论了榄香烯乳对癌细胞搬迁、侵袭的效应，并从microRNA（miRNA）视点评论其分子机制。
1资料与办法
1.1试验资料
榄香烯乳，购自华立金港制药有限公司；人大肠癌细胞系HCT-116，本院安排细胞生物库冻存；RNA提取试剂TriIzol购自美国Invitrogen公司；基底膜胶（Matrigel）购自BD公司；RPMI1640、胎牛血清均购自Gibco公司。
1.2试验办法
1.2.1细胞培育及药物处理 人大肠癌HCT-116细胞置于含5%胎牛血清的RPMI-1640液中，在37°CCO2培育箱中惯例培育。待细胞至对数成长期，选用不同浓度（10、20、40μg/mL）的榄香烯乳处理，以RPMI-1640替代榄香烯乳处理细胞作为空白对照组，3复孔，备测。
1.2.2癌细胞搬迁检测 选用划痕法检测癌细胞搬迁才干，具体进程参照文献[6]办法进行。根本操作进程如下：（1）先用marker笔在6孔板背面，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5～1.0cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。（2）相同办法培育细胞至对数成长期，消化、计数，运用培育基配制成浓度为8×105个/mL的细胞悬液，6孔细胞培育板中每孔参加1mL细胞悬液，放入37℃，5%CO2培育箱中培育直至细胞铺满单层。（3）用100μL枪头沿培育板底部呈“一”字形划痕；用枪头比着直尺，尽量笔直于背面的横线划痕，枪头要笔直，不能歪斜。（4）弃去培育基，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，用培育基稀释药物至所需浓度，每孔参加1000μL相应的含药培育基，一起建立阴性对照组。（5）6孔细胞培育板置于37℃5%CO2培育箱中培育24h，摄影。
1.2.3细胞侵袭检测 该试验在Transwell板上进行，具体进程参照文献[7-8]办法进行。倒置显微镜（×100）调查穿过膜的细胞数。每张膜中心部分和周围部分各随机取3个视界，计数每个视界内穿过聚碳酸酯膜微孔的细胞数。
1.2.4miR-155mRNA水平检测 选用荧光实时定量PCR检测。选用Trizol办法抽提细胞总RNA抽提，选用试剂盒逆转录为cDNA。miR-155定量PCR上游引物：5′-CGCGCTTAATGCTAATCGTGA-3′；下流引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，巨细为62bp。内参GAPDH上游引物：5-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3′；下流引物：5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3′，巨细为115bp。循环条件及计算办法参照文献[9]进行。
1.3计算学办法
选用SPSS17.0计算软件包进行计算学处理，所得到的数据均以均数±标准差标明，P<0.05为差异有计算学含义。
2成果
2.1榄香烯乳对大肠癌细胞搬迁的影响
选用划痕法调查榄香烯乳对癌细胞搬迁的影响。与对照组癌细胞（图1A）比较，榄香烯乳处理组癌细胞搬迁速度较慢，搬迁间隔显着低于空白对照组（图1B），后者划痕两边癌细胞已趋交融。
2.2榄香烯乳对大肠癌细胞侵袭的影响
搜集经榄香烯乳处理的HCT116细胞，选用Transwell检测癌细胞侵袭状况。对照组、不同浓度（10、20、40μmol/L）榄香烯乳处理组穿过滤膜的细胞分别为（43.8±1.7）、（31.6±1.6）、（18.5±1.5）和（8.8±1.2）个。计算学剖析提示，细胞侵袭呈浓度依赖性削减（P<0.05）。
2.3榄香烯乳对大肠癌细胞miR-155的影响
以榄香烯乳处理大肠癌HCT-116细胞后，选用荧光实时定量CR检测。成果发现，与对照组比较，榄香烯乳各处理组miR-155mRNA水平显着下调，呈浓度依赖性（P<0.05）。见图2。
3评论
搬迁性是搬运性癌细胞重要特征之一。在成体安排中大大都正常细胞不具有搬迁性，而恶性肿瘤细胞一般具有非常活泼的搬迁性。体外培育时，正常细胞具有搬迁的接触按捺，因而呈单层成长；而癌细胞丧失了搬迁的接触按捺，然后呈多层堆叠成长。本研讨发现，大肠癌HCT-116细胞具有较强的搬迁性，而经榄香烯乳处理后，细胞搬迁间隔显着缩短。
恶性肿瘤的首要生物学特性是侵袭和搬运，而这也是恶性肿瘤患者逝世的首要原因之一。肿瘤侵袭与搬运进程非常复杂，虽然不同品种肿瘤侵袭、搬运特性有所不同，但侵袭、搬运进程中的关链进程根本相同。恶性肿瘤的搬运进程首要包含肿瘤细胞的别离掉落（即恶性肿瘤细胞从原发肿瘤病灶脱离），然后向周围安排侵袭，当肿瘤细胞从原发肿瘤别离掉落后，有必要穿透原发肿瘤周围的宿主结缔安排才干进入循环体系，之后经过血液循环和淋巴循环游走到远处安排器官，构成继发性肿瘤。在此进程中，肿瘤细胞侵袭细胞外基质是重要的进程。在本研讨体外侵袭试验中，调查到人大肠癌HCT-116细胞具有较强的侵袭才干，经榄香烯乳处理后，癌细胞侵袭才干显着下降，且呈浓度依赖性（P<0.05）。由此阐明，榄香烯乳对大癌细胞侵袭具有显着的按捺效果。
MicroRNAs是一类短序列、非编码、具有调控功用的长为20～24nt单链小分子RNA。很多依据标明，microRNAs的反常表达与多种人类癌症的发作密切相关[10]。MicroRNAs的发现和运用为恶性肿瘤的确诊和医治供给了新的靶点。试验研讨标明，miR-155过表达和多种上皮体系来历恶性肿瘤的发作及其恶性生物学表型密切相关。在许多实体瘤如乳腺癌、大肠癌等多种实体瘤安排或细胞中高表达[11-12]，但现在尚不清楚miR-155在大肠癌细胞侵袭中的可能效果。本研讨以榄香烯乳处理大肠癌细胞后，以蛋白质印迹办法检测MK基因蛋白水平，成果显现，榄香烯乳各处理组miR-155水平显着下调，且呈浓度依赖性（P<0.05）。因而，笔者估测榄香烯乳按捺大肠癌细胞搬迁侵袭，可能与下调miR-155mRNA有关。
本研讨成果提示，榄香烯乳可显着下降大肠癌细胞侵袭才干，下调miR-155表达是其重要机制之一。
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（收稿日期：2012-10-18 本文修改：陈 俊）
