SD大鼠附睾尾部上皮原代细胞不同培养方法的研究

疾病
中西医结合心血管病电子杂志
2018年03月06日 17:22

SD大鼠肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

赵文珍++何颖红++王云涛++杨勇琴

【摘要】目的:为获得生长状态佳,精子少的附睾上皮原代培养细胞。方法:采取两种方法,取SD大鼠附睾上皮组织,均以酶消化为主,制成细胞悬液,进行培养。结果:方法一:制成的细胞悬液中有较多的精子存在,培养的细胞中成纤维细胞占较大比例;方法二:培养结果比较好,精子少或无,培养的细胞中绝大部分为上皮细胞,且生长速度较快。结论:获得生长状态佳,精子少的附睾上皮原代培养细胞,为研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能提供了必要的基础和条件。

【关键词】SD大鼠;附睾上皮;原代细胞培养

Study on primary cultured SD rat epididymal epithelial cell culture methods of different

Zhao Wenzhen He YingHong Wang YunTao Yang YongQin

Department of Histology and Embryology,School of Basic Medicine,Dali University,Dali 671000,China

[Abstract]objective:To obtain good growth state,less sperm epididymal epithelial cells in primary culture.Method:Adopt two kinds of methods.The epididymal epithelial tissues of SD rats were mainly made by enzyme digestion,were made cell suspension and were cultured.Results:Cultured fibroblasts accounted for a large proportion from the first method;The culture results from the second method are good,the sperm less or no,cultured cells for the vast majority of epithelial cells,and the growth speed.Conclusion:To obtain good growth state conclusion,provides the basis and conditions necessary for the study of epididymis and sperm function maturation and fertilization of the key molecules associated function.

[Key words]SD rat;The epididymal epithelium;Primary cell culture

附睾是精子功能成熟的场所,也一直是胚胎学和生殖医学的研究热点之一。哺乳类动物睾丸产生的精子须经过附睾后才能获得受精能力,即精子从结构的成形进入功能的成熟阶段,其中重要的标志之一是精子运动能力的获得。精子在不同区域的附睾组织运行中,附睾上皮的基因表达有很大差异,并且从附睾头部至尾部精子运动能力逐渐增强[1]。因此,在研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能时,附睾上皮原代培养的细胞质量尤为重要。本研究采取两种方法,取SD大鼠附睾尾部上皮组织,均以酶消化为主,制成细胞悬液,进行原代培养。为研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能提供了必要的条件。

资料与方法

实验动物:雄性SD大鼠24只,年龄10~12周,购自大理学院动物房。随机分为两组,每组4只,每次实验用两组,重复3次。

主要试剂与仪器:①试剂:蛋白酶K,胶原酶IV,胰蛋白酶,青霉素/链霉素,胎牛血清,DMEM,戊巴比妥钠,细胞培养皿,离心管等耗材。⑵仪器:水浴摇床,CO2培养箱,体视镜,相差显微镜,5810R低温离心机。

方法:①附睾尾部上皮原代细胞培养方法一[2-3]:3.5%戊巴比妥钠0.6~1.0ml麻醉SD大鼠,取附睾尾部反复剪碎,去除上清。胶原酶IV、胰蛋白酶消化,200目滤网过滤,重悬液相差显微镜下观察消化情况及细胞数,置于CO2培养箱中培养,8h后观察细胞生长情况,隔夜换液,5天左右细胞生长可达80%~90%融合。②附睾尾部上皮原代细胞培养分法二[4]:麻醉和取材同方法一。解剖显微镜下取附睾管粗略剪碎。胶原酶IV消化后彻底剪碎附睾管,蛋白酶K消化后,重悬液相差显微镜下观察消化情况及细胞数,置于CO2培养箱中培养。隔夜换液,2~3天细胞生长可达80%~90%融合。

结果

两种方法制作的细胞悬液结果:结果显示:细胞悬液多为单个细胞,消化完全,其中方法一的悬液中精子较多,方法二的悬液中精子较少或无(图1)。

图1:细胞悬液(A:方法一;B:方法二;×100)

两种方法培养的结果:结果显示:方法一:成纤维细胞含量较多,上皮细胞较少;方法二:绝大部分为上皮细胞,细胞间紧密相靠、互相衔接,呈“铺路石”状,具有连接成片的能力(图2)。

图2:附睾尾部上皮原代培养细胞(A:方法一;B:方法二;×100)

讨论

原代培养细胞的质量是能否成功进行体外精子成熟相关因子研究的关键和基础。原代培养是指细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段,三个步骤:分离组织;解剖或解离组织块;接种于培养器皿中培养。培养有两种方式:一种是将组织块贴附于适宜的基质中,细胞自组织块向外迁移生长;一种是用机械法或酶消化法处理组织块制成细胞悬液,黏附于基质中生长。居于以上原理和方法,本研究在培养附睾尾部上皮细胞过程中,采取两种方法进行培养,均以酶消化为主,制成细胞悬液,来进行培养。两种方法相比较,方法一:制成的细胞悬液中有较多的精子存在,培养的细胞中成纤维细胞占较大比例;方法二:培养结果比较好,精子少或无,培养的细胞中绝大部分为上皮细胞,且生长速度较快。因此,通过两种培养方法的比较,获得了生长状态佳,精子少的原代培养细胞,为研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能提供了必要的条件。同时,建立了附睾尾部上皮原代培养细胞的方法,为其它实验研究提供了稳定的技术平台。

参考文献

[1]Amann RP,Hammerstedt RH,Veeramachaneni DN.The epididymis and sperm maturation:a perspective.Reproduction,fertility,and development,1993,5:361-381.

[2]Chen YC,Bunick D,Bahr JM,Klinefelter GR,Hess RA.Isolation and culture of epithelial cells from rat ductuli efferentes and initial segment epididymidis.Tissue Cell,1998 Feb;30(1):1-13.

[3]Klinefelter GR,Amann RP,Hammerstedt RH.Culture of principal cells from the rat caput epididymidis.Biol Reprod,1982,26(5):885-901.

[4]Reyes-Moreno C,Laflamme J,Frenette G,Sirard MA,Sullivan R.Spermatozoa modulate epididymal cell proliferation and protein secretion in vitro.Mol Reprod Dev,2008,75(3):512-20.

【摘要】目的:为获得生长状态佳,精子少的附睾上皮原代培养细胞。方法:采取两种方法,取SD大鼠附睾上皮组织,均以酶消化为主,制成细胞悬液,进行培养。结果:方法一:制成的细胞悬液中有较多的精子存在,培养的细胞中成纤维细胞占较大比例;方法二:培养结果比较好,精子少或无,培养的细胞中绝大部分为上皮细胞,且生长速度较快。结论:获得生长状态佳,精子少的附睾上皮原代培养细胞,为研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能提供了必要的基础和条件。

【关键词】SD大鼠;附睾上皮;原代细胞培养

Study on primary cultured SD rat epididymal epithelial cell culture methods of different

Zhao Wenzhen He YingHong Wang YunTao Yang YongQin

Department of Histology and Embryology,School of Basic Medicine,Dali University,Dali 671000,China

[Abstract]objective:To obtain good growth state,less sperm epididymal epithelial cells in primary culture.Method:Adopt two kinds of methods.The epididymal epithelial tissues of SD rats were mainly made by enzyme digestion,were made cell suspension and were cultured.Results:Cultured fibroblasts accounted for a large proportion from the first method;The culture results from the second method are good,the sperm less or no,cultured cells for the vast majority of epithelial cells,and the growth speed.Conclusion:To obtain good growth state conclusion,provides the basis and conditions necessary for the study of epididymis and sperm function maturation and fertilization of the key molecules associated function.

[Key words]SD rat;The epididymal epithelium;Primary cell culture

附睾是精子功能成熟的场所,也一直是胚胎学和生殖医学的研究热点之一。哺乳类动物睾丸产生的精子须经过附睾后才能获得受精能力,即精子从结构的成形进入功能的成熟阶段,其中重要的标志之一是精子运动能力的获得。精子在不同区域的附睾组织运行中,附睾上皮的基因表达有很大差异,并且从附睾头部至尾部精子运动能力逐渐增强[1]。因此,在研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能时,附睾上皮原代培养的细胞质量尤为重要。本研究采取两种方法,取SD大鼠附睾尾部上皮组织,均以酶消化为主,制成细胞悬液,进行原代培养。为研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能提供了必要的条件。

资料与方法

实验动物:雄性SD大鼠24只,年龄10~12周,购自大理学院动物房。随机分为两组,每组4只,每次实验用两组,重复3次。

主要试剂与仪器:①试剂:蛋白酶K,胶原酶IV,胰蛋白酶,青霉素/链霉素,胎牛血清,DMEM,戊巴比妥钠,细胞培养皿,离心管等耗材。⑵仪器:水浴摇床,CO2培养箱,体视镜,相差显微镜,5810R低温离心机。

方法:①附睾尾部上皮原代细胞培养方法一[2-3]:3.5%戊巴比妥钠0.6~1.0ml麻醉SD大鼠,取附睾尾部反复剪碎,去除上清。胶原酶IV、胰蛋白酶消化,200目滤网过滤,重悬液相差显微镜下观察消化情况及细胞数,置于CO2培养箱中培养,8h后观察细胞生长情况,隔夜换液,5天左右细胞生长可达80%~90%融合。②附睾尾部上皮原代细胞培养分法二[4]:麻醉和取材同方法一。解剖显微镜下取附睾管粗略剪碎。胶原酶IV消化后彻底剪碎附睾管,蛋白酶K消化后,重悬液相差显微镜下观察消化情况及细胞数,置于CO2培养箱中培养。隔夜换液,2~3天细胞生长可达80%~90%融合。

结果

两种方法制作的细胞悬液结果:结果显示:细胞悬液多为单个细胞,消化完全,其中方法一的悬液中精子较多,方法二的悬液中精子较少或无(图1)。

图1:细胞悬液(A:方法一;B:方法二;×100)

两种方法培养的结果:结果显示:方法一:成纤维细胞含量较多,上皮细胞较少;方法二:绝大部分为上皮细胞,细胞间紧密相靠、互相衔接,呈“铺路石”状,具有连接成片的能力(图2)。

图2:附睾尾部上皮原代培养细胞(A:方法一;B:方法二;×100)

讨论

原代培养细胞的质量是能否成功进行体外精子成熟相关因子研究的关键和基础。原代培养是指细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段,三个步骤:分离组织;解剖或解离组织块;接种于培养器皿中培养。培养有两种方式:一种是将组织块贴附于适宜的基质中,细胞自组织块向外迁移生长;一种是用机械法或酶消化法处理组织块制成细胞悬液,黏附于基质中生长。居于以上原理和方法,本研究在培养附睾尾部上皮细胞过程中,采取两种方法进行培养,均以酶消化为主,制成细胞悬液,来进行培养。两种方法相比较,方法一:制成的细胞悬液中有较多的精子存在,培养的细胞中成纤维细胞占较大比例;方法二:培养结果比较好,精子少或无,培养的细胞中绝大部分为上皮细胞,且生长速度较快。因此,通过两种培养方法的比较,获得了生长状态佳,精子少的原代培养细胞,为研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能提供了必要的条件。同时,建立了附睾尾部上皮原代培养细胞的方法,为其它实验研究提供了稳定的技术平台。

参考文献

[1]Amann RP,Hammerstedt RH,Veeramachaneni DN.The epididymis and sperm maturation:a perspective.Reproduction,fertility,and development,1993,5:361-381.

[2]Chen YC,Bunick D,Bahr JM,Klinefelter GR,Hess RA.Isolation and culture of epithelial cells from rat ductuli efferentes and initial segment epididymidis.Tissue Cell,1998 Feb;30(1):1-13.

[3]Klinefelter GR,Amann RP,Hammerstedt RH.Culture of principal cells from the rat caput epididymidis.Biol Reprod,1982,26(5):885-901.

[4]Reyes-Moreno C,Laflamme J,Frenette G,Sirard MA,Sullivan R.Spermatozoa modulate epididymal cell proliferation and protein secretion in vitro.Mol Reprod Dev,2008,75(3):512-20.

【摘要】目的:为获得生长状态佳,精子少的附睾上皮原代培养细胞。方法:采取两种方法,取SD大鼠附睾上皮组织,均以酶消化为主,制成细胞悬液,进行培养。结果:方法一:制成的细胞悬液中有较多的精子存在,培养的细胞中成纤维细胞占较大比例;方法二:培养结果比较好,精子少或无,培养的细胞中绝大部分为上皮细胞,且生长速度较快。结论:获得生长状态佳,精子少的附睾上皮原代培养细胞,为研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能提供了必要的基础和条件。

【关键词】SD大鼠;附睾上皮;原代细胞培养

Study on primary cultured SD rat epididymal epithelial cell culture methods of different

Zhao Wenzhen He YingHong Wang YunTao Yang YongQin

Department of Histology and Embryology,School of Basic Medicine,Dali University,Dali 671000,China

[Abstract]objective:To obtain good growth state,less sperm epididymal epithelial cells in primary culture.Method:Adopt two kinds of methods.The epididymal epithelial tissues of SD rats were mainly made by enzyme digestion,were made cell suspension and were cultured.Results:Cultured fibroblasts accounted for a large proportion from the first method;The culture results from the second method are good,the sperm less or no,cultured cells for the vast majority of epithelial cells,and the growth speed.Conclusion:To obtain good growth state conclusion,provides the basis and conditions necessary for the study of epididymis and sperm function maturation and fertilization of the key molecules associated function.

[Key words]SD rat;The epididymal epithelium;Primary cell culture

附睾是精子功能成熟的场所,也一直是胚胎学和生殖医学的研究热点之一。哺乳类动物睾丸产生的精子须经过附睾后才能获得受精能力,即精子从结构的成形进入功能的成熟阶段,其中重要的标志之一是精子运动能力的获得。精子在不同区域的附睾组织运行中,附睾上皮的基因表达有很大差异,并且从附睾头部至尾部精子运动能力逐渐增强[1]。因此,在研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能时,附睾上皮原代培养的细胞质量尤为重要。本研究采取两种方法,取SD大鼠附睾尾部上皮组织,均以酶消化为主,制成细胞悬液,进行原代培养。为研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能提供了必要的条件。

资料与方法

实验动物:雄性SD大鼠24只,年龄10~12周,购自大理学院动物房。随机分为两组,每组4只,每次实验用两组,重复3次。

主要试剂与仪器:①试剂:蛋白酶K,胶原酶IV,胰蛋白酶,青霉素/链霉素,胎牛血清,DMEM,戊巴比妥钠,细胞培养皿,离心管等耗材。⑵仪器:水浴摇床,CO2培养箱,体视镜,相差显微镜,5810R低温离心机。

方法:①附睾尾部上皮原代细胞培养方法一[2-3]:3.5%戊巴比妥钠0.6~1.0ml麻醉SD大鼠,取附睾尾部反复剪碎,去除上清。胶原酶IV、胰蛋白酶消化,200目滤网过滤,重悬液相差显微镜下观察消化情况及细胞数,置于CO2培养箱中培养,8h后观察细胞生长情况,隔夜换液,5天左右细胞生长可达80%~90%融合。②附睾尾部上皮原代细胞培养分法二[4]:麻醉和取材同方法一。解剖显微镜下取附睾管粗略剪碎。胶原酶IV消化后彻底剪碎附睾管,蛋白酶K消化后,重悬液相差显微镜下观察消化情况及细胞数,置于CO2培养箱中培养。隔夜换液,2~3天细胞生长可达80%~90%融合。

结果

两种方法制作的细胞悬液结果:结果显示:细胞悬液多为单个细胞,消化完全,其中方法一的悬液中精子较多,方法二的悬液中精子较少或无(图1)。

图1:细胞悬液(A:方法一;B:方法二;×100)

两种方法培养的结果:结果显示:方法一:成纤维细胞含量较多,上皮细胞较少;方法二:绝大部分为上皮细胞,细胞间紧密相靠、互相衔接,呈“铺路石”状,具有连接成片的能力(图2)。

图2:附睾尾部上皮原代培养细胞(A:方法一;B:方法二;×100)

讨论

原代培养细胞的质量是能否成功进行体外精子成熟相关因子研究的关键和基础。原代培养是指细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段,三个步骤:分离组织;解剖或解离组织块;接种于培养器皿中培养。培养有两种方式:一种是将组织块贴附于适宜的基质中,细胞自组织块向外迁移生长;一种是用机械法或酶消化法处理组织块制成细胞悬液,黏附于基质中生长。居于以上原理和方法,本研究在培养附睾尾部上皮细胞过程中,采取两种方法进行培养,均以酶消化为主,制成细胞悬液,来进行培养。两种方法相比较,方法一:制成的细胞悬液中有较多的精子存在,培养的细胞中成纤维细胞占较大比例;方法二:培养结果比较好,精子少或无,培养的细胞中绝大部分为上皮细胞,且生长速度较快。因此,通过两种培养方法的比较,获得了生长状态佳,精子少的原代培养细胞,为研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能提供了必要的条件。同时,建立了附睾尾部上皮原代培养细胞的方法,为其它实验研究提供了稳定的技术平台。

参考文献

[1]Amann RP,Hammerstedt RH,Veeramachaneni DN.The epididymis and sperm maturation:a perspective.Reproduction,fertility,and development,1993,5:361-381.

[2]Chen YC,Bunick D,Bahr JM,Klinefelter GR,Hess RA.Isolation and culture of epithelial cells from rat ductuli efferentes and initial segment epididymidis.Tissue Cell,1998 Feb;30(1):1-13.

[3]Klinefelter GR,Amann RP,Hammerstedt RH.Culture of principal cells from the rat caput epididymidis.Biol Reprod,1982,26(5):885-901.

[4]Reyes-Moreno C,Laflamme J,Frenette G,Sirard MA,Sullivan R.Spermatozoa modulate epididymal cell proliferation and protein secretion in vitro.Mol Reprod Dev,2008,75(3):512-20.

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